С.Ф. Коваль, В.П. Шаманин  "Растение в опыте"

 

Еще работами А.А. Ухтомского было установлено, что обусловленная адаптивными реакциями компенсация внешнего влияния неотделима от процесса обычного возбуждения клетки. В этом смысле биологические явления принципиально неделимы на физиологические и патологические. Именно на этом основана неспецифичносгь и однотипность клеточных реакций на самые различные факторы. Внешнее воздействие ослабляет связи в липопротеиновых, фосфолипидных, пигмент-белково- липидных комплексах. Это обуславливает нарушение регуляторной функции мембран, увеличивает выход электролитов из клет ки. Отделенные друг от друга компоненты комплексов подвергаются изменениям: белок - главным образом, конформационным, а липиды - окислительным с образованием перекисей и свободных радикалов. В итоге устойчивость клетки к экстремальным воздействиям определяется прочностью связи между компонентами в биокомплексах. Поскольку конформация белка определяется последовательностью аминокислот, очевидно, что устойчивость биокомплексов детерминирована генотипом.

Фаза тревоги на клеточном уровне представлена неспецифическими реакциями, к которым относятся: 1) повышение проницаемости мембран, 2) выход кальция в цитоплазму, 3) сдвиг pH цитоплазмы в кислую сторону, 4) активация сборки цитоскелета и связанное с этим увеличение вязкости цитоплазмы, 5) усиление поглощения кислорода и образования свободных радикалов, активация протонной помпы, препятствующей нарушению ионного гомеостаза клетки. Изменение конформации мембран достаточно надежно определяется по характеру биоэлектрической реакции клетки на внешнее воздействие, прижизненному окрашиванию клеток, выходу из клетки в окружающий раствор ряда веществ. Наряду с указанными методами, которые отражают изменение функций мембран, возможно и непосредственное определение структуры с использованием электронного парамагнитного резонанса и других физических методов. Методы диагностики статической устойчивости взаимозаменимы в силу единства процессов повреждения ультраструктуры клетки, а преимущественное использование того или иного из них во многом диктуется наличием оборудования, подготовленностью персонала или традицией данной научной группы.

В любом эксперименте не следует забывать о неспецифичности многих реакций, в силу которой, тестирование указывает только на величину возникших повреждений и ничего не говорит о природе мы шившего их жаремального фактора. И, если этот фактор не был задан » строго нормированных условиях опыта, следуете особой тщательностью контролировать отсутствие побочных нежелательных воздействий на растение.

В последнее время в исследовании внутриклеточных механизмов поражения и устойчивости большую роль играет анализ сверхслабой люминесценции фосфолипидов, имеющий 2 отчетливых максимума в области 4000 А и 5200 А. Установлено, что это излучение спонтанно испускается всеми живыми клетками и прекращается в анаэробной среде. Исследования школы Б.Н. Тарусова показали, что сверхслабая хемилюминесценция вызвана рекомбинацией радикалов, возникающих в основном при окислении липидов. В норме этот процесс поддерживается на постоянном уровне наличием в клетке фонда антиоксидантов. В этом процессе антиоксидант окисляется («выгорает»), и стационарное течение окислительно-восстановительных реакций может поддерживаться при непрерывной подаче антиоксиданта на мембраны. К нативным антиоксидантам клетки относятся токоферол, аскорбиновая кислота, цистеин и другие восстановители.

В процессе фотосинтеза происходит образование супероксидного радикала кислорода [Островская, 1993], способного нарушить работу хлоропластов. Его обезвреживание производится специальным ферментом супероксиддисмутазой и естественными антиоксидантами.

При изменении силы действия любого фактора в пределах нормы реакции клетки интенсивность сверхслабого свечения изменяется линейно. Но при достижении летального предела происходит резкое усиление свечения (вспышка), вызванное израсходованием фонда антиоксидантов и началом цепной реакции свободно-радикального окисления, приводящего к гибели клетки. Защита от гибели может быть достигнута заблаговременным введением в среду как естественных для клетки, так и синтетических антиоксидантов, например, пирокатехина. В этом прослеживается аналогия между поражением клетки экологическими факторами и ионизирующим излучением, в основе которого также лежат процессы свободнорадикального окисления. Причиной первоочередного поражения фосфолипидов является не только высокая реакционная способность этих соединений по отношению к окислению, но и то, что при любых отклонениях условий от нормы именно на это звено ложится большая энергетическая нагрузка. Сущность адаптации состоит в поддержании равновесия процессов в клетке, что требует энергетических затрат, усиливающих напряженность транспорта электронов через фосфолипиды [Тарусов, 1970].К сожалению, имеющиеся в литературе данные не позволяют еще сделать однозначный вывод о временной последовательности описанных выше процессов диссоциации биокомплексов и окисления фосфолипидов. В случае ионизирующих излучений, несомненно, первичным является появление перекисей липидов, а образующиеся при этом высокоактивные радиотоксины вызывают нарушения в структуре мембран и подавляют синтетические процессы. С другой стороны, имеются данные [Воробьев и др., 1972) о более высокой чувствительности биоэлектрической реакции клетки к повышению содержания солей по сравнению с изменением сверхслабой хемилюминесценции. Генерация биопотенциала определяется функционированием мембран. Поэтому для умеренного экологического воздействия справедливо предположение о первичности конформационных перестроек, а не окисления липидов.

В последнем случае усиление хемилюминесценции должно расматриваться как вторичный эффект поражения клетки, запаздывание которого против первичных изменений по нашим масштабам времени несущественно. Это позволяет использовать контроль за вспышкой сверхслабой хемилюминесценции как индикатор наиболее ранних процессов повреждения и для определения порога гибели клеток в экстремальных условиях. Сложность требуемой для этого метода аппаратуры искупается быстротой определения, недоступной для методов ос копанных на сорбции красителей, вымываемости электролитов, определении прочности пигмент-белковых комплексов и т.д. Для этих методов всегда существует опасность крупных биохимических изменений за время подготовки образца и в ходе его анализа. Особенно велика вероятность возникновения артефакта в ходе приготовления препарата белка (для определения вязкости, амперметрического титрования сульфгидральных групп), которое производится при близкой к нулю температуре. Низкая температура, защищающая белки от ферментативного гидролиза, неизбежно вызовет конформационную перестройку структуры, и исследователь не имеет никакой гарантии, что данный эффект будет одинаковым во всех вариантах. Поэтому быстрота, чувствительность и значительная гарантия от артефактов делают метод контроля сверхслабого свечения особенно ценным.

Выше были рассмотрены некоторые стороны процесса повреждения клетки. Сейчас уместно остановиться на явлениях устойчивости. Эффект внешнего воздействия определяется первичной поврежденностью клетки, развитием в ней н вторичных деструктивных процессов и репарационной способностью. Конечные результаты эксперимента будут зависеть от того, какой из и их процессов играет ведущую роль в изучаемом объекте.

Кроме генетически обусловленной структуры биополимеров на первичную устойчивость (чувствительность) влияют антиденатураторы белков; сахара, глицерзин и др. и стабилизация мембран ионами кальция. Хорошо известное защитное действие кальция при охлаждении и засолении также связано с упрочнением мембран.

Развитие деструктивных процессов будет определяться истощением запаса антиоксидантов, цепным характером окислительного разрушения фосфолипидов, гидролизом полимеров освободившимися из разрушенных лизосом ферментами и самоотравлением клетки продуктами распада.

По имеющимся в литературе данным антиоксидантная активность, определяемая по ослаблению хемолюминесценции при нормальных условиях или по повышению температуры резкого усиления свечения, возрастает при переходе от чистых линий к межлинейным гибридам (табл.2.1). Наибольшей антиоксидантной активностью обладают двойные меж линейные гибриды [Доскочи др., 1972]. По нашим наблюдениям (табл. 2.2). в процессе неблагоприятного воздействия происходит неуклонное уменьшение йодного титра тканей, который характеризует сумму высокоактивных восстановленных соединений расходуемых на защиту от деструкции клеток.

Таблица 2.1. Сверхслабая люминесценция самоопыленных линий, простых двойных гибридов кукурузы по данным [Доскоч и др., 1972] Образец Интенсивность сверхслабой хеми­люминесценции при 25° С, имп/мин Температурный максимум хемилюминесценции, <° Самоопыленные линии ВИР-44 1476 + 34 40 ВИР-40 1241+53 41 ВИР-43 1047 + 40 43 ВИР-38 738 + 48 45 Межлинейные гибриды Светоч (ВИР-40 X ВИР-43) 1022 + 32 43 Слава (ВИР-44 X ВИР-38) 852 + 43 44 Двойной межлинейный гибрид ВИР-42 (Слава X Светоч) 598 + 26 L. 47

 

Таблица 2.2. Изменение восстановительной активности органов пшеницы Лютесценс 758 в процессе завядания (мл 0,05 N йода/г сухого веса) Орган Продолжительность завядания, часы 0 4 9 24 1-ый лист 14,3 17,6 13,2 8,4 2-ой лист 10,3 12,5 9,5 5,8 Зона роста 3-го листа 17,3 18,6 12,7 7,8

 

При глубокой деструкции белков и дезаминировании аминокислот наступает отравление клеток свободным аммиаком. Выживание на этом этапе повреждения зависит от размера пула органических кислот, которые связывают аммиак и защищают клетку от самоотравления. И, напротив, предварительное (до повреждения) обогащение клетки аммонием, альдегидами, перекисями стимулирует развитие деструктивных процессов при повреждении. Именно с этим связано понижение устойчивости на фоне азотного перекорма при повышении концентрации кислорода в атмосфере или при интенсивном освещении в последующий за неблагоприятным воздействием период времени.

Репарационные процессы в живой клетке идут непрерывно и, следовательно, хронологически совпадают со следующей за поражением деструкцией структур, частично компенсируют ее. Поэтому усиление синтетических (репарационных) процессов в клетках до их повреждения ослабляет проявление последующих деструктивных эффектов. Главную роль в репарационных процессах играет высокая активность ферментативного синтеза и энергообмена, из чего вытекает значение для устойчивости стимуляции синтеза белка. С этим связаны защитные и репарирующие эффекты обработки растений стимуляторами синтеза нуклеиновых кислот и белка - аденином, кинетином и др.

Таблица 2.3. Динамика сухого веса всходов огурцов (мг/раст.) после однократного охлаждения (4°С х 10 часов) в зависимости от внекорневой обработки растворами азотных солей Срок обработки Вариант Время после охлаждения, дней 0 5 10 15 Без обработки контроль 50 118 356 514 охлаждение - 97 258 316 Обработка до ох­лаждения контроль 56 127 361 543 охлаждение - 81 187 519 Обработка после охлаждения контроль 50 131 374 585 охлаждение - 88 318 562

 

Стимуляция репарационных процессов в ряде случаев может быть достигнута и своевременным введением необходимых для синтеза белка метаболитов. Так, длительное подавление роста и синтетических процессов, которое имеет место у теплолюбивых культур после охлаждения, может быть преодолено опрыскиванием растений смесью сахарозы, азотнокислого кальция и мочевины (табл. 2.3). В данном опыте смесью этих веществ (концентрация 20,10 и 5 г/л соответственно) опрыскивались семядоли и первый растущий лист за 3 дня до охлаждения или в течение 3 дней после охлаждения. Контрольные растения опрыскивались водой. Контроль за накоплением сухого веса растений показал, что без нанесения лечебной смеси поврежденные холодом растения не восстанавливают темпов накопления биомассы. В случае же предварительного или последующего опрыскивания депрессия синтеза быстро заканчивается, и через 15 дней поврежденные растения догоняли контроль. Большая депрессия накопления сухого вещества в варианте предварительной обработки связана, по нашему мнению, с повышенной в момент повреждения концентрацией аммиака (как вследствие деструкции белка, так и за счет введения азотных солей). Это увеличивает нагрузку на систему детоксикации и задерживает наступление стимуляции синтетических процессов. Все сказанное выше относилось главным образом к устойчивости и повреждению внутриклеточных структур. Но в какой-то мере перечисленные закономерности справедливы и в отношении процессов энергообмена. Не вызывает сомнения, что обратимая денатурация мембранных белков, окисление фосфолипидов и конформационные перестройки структуры мембран приводят к нарушению энергообмена и накопления АТФ, что в конечном итоге выражается в виде разобщения дыхания от фосфорилирования. Дефицит синтеза АТФ ведет к дальнейшему дефосфорилированию АТФ с образованием 3,5-аденозинмонофосфата. По имеющимся в литературе данным (полученным на животных) АМФ может являться сигналом для генетической активации синтеза РНК, белков, увеличения числа и размеров митохондрий, а значит, приводить к усилению синтеза АТФ и нормализации энергообмена. Видимо, такая картина может иметь место как при усилении расходования АТФ, так и при нарушении ее синтеза. О.А. Семихатова [1965] нашла у многих высокогорных растений повышенную интенсивность дыхания, связанную с большими энергетическими затратами на репарацию субклеточных повреждений, вызванных ночными заморозками. Понятно, что даже при успешном завершении репарационного процесса, повышенные расходы углеводов на дыхание должны привести к снижению чистой продуктивности фотосинтеза и урожая. В случае более глубокого повреждения, усиление газообмена имеет причиной не только расходы на репарацию, но и энергетическое обесценивание дыхания за счет его разобщения от фосфорилирования [Семихатова, 1974]. Сейчас всеми исследователями признается нарушение фосфорилирования и аэробного дыхания как универсальный элемент поражения любыми факторами, а возникшую при этом аэробную ферментацию по типу брожения считают не патологическим, а компенсаторным процессом. В норме гликолитическое фосфорилирование подавляется окислительным, которое использует все фонды АДФ в клетке. Но на неблагоприятном фоне филогенетически более молодое аэробное дыхание разобщается от фосфорилирования и древние механизмы гликолитического фосфорилирования больше не подавляются конкуренцией за АТФ и минеральный фосфор. Этот случай является интересной иллюстрацией биогенетического закона Мюллера - Геккеля, современная трактовка которого не только включает положение о рекапитуляции признаков филогенетических предков, но и предполагает высокую стабильнсть наиболее древних систем и органов по сравнению с более молодыми. Активизация аэробного гликолиза может рассматриваться как аварийное пополнение энергетических фондов клетки, позволяющее переносить неблагоприятные условия, угнетающие окислительное фосфорилирование. Имеются данные о высокой устойчивости к неблагоприятным воздействиям циклического фосфорилирования. Циклическое и нециклическое фосфорилирование, например, более устойчивы к действию высоких и низких температур, чем газообмен фотосинтеза [Лютова и Кислюк, 1971]. Известно также [Гриф, 1966], что к первым ответным реакциям клетки относятся прекращение митозов и растяжения клеток, а синтез нуклеиновых кислот продолжается еще некоторое время после их подавления. Поскольку синтетические процессы требуют энергетических затрат, мы вправе считать, что нарушение энергообмена не является первичным эффектом поражения, а развивается только при длительном и глубоком нарушении физиологии клетки.

Сказанное выше, конечно, не исключает возможности не посредственного действия некоторых факторов (например, ядов) на шергообмен. Но в большинстве случаев контроль за устойчивостью к повреждению по разобщению дыхания определяет только конечные фазы деструкции клетки, ранее которых имел место целый ряд адаптивных реакций.

В сжатом изложении механизмов статической устойчивости невозможно избежать некоторого схематизма, неполноты в освещении отдельных моментов реагирования клетки и ее адаптации. Но здесь мы и не преследуем цель всестороннего освещения вопроса - это задача отдельной монографии, которая, к сожалению, до настоящего времени еще не написана. В настоящем подразделе предусматривалось изложить только наиболее общие представления о критических, наименее устойчивых, системах клетки, о временном порядке реагирования ее биохимических процессов на стресс. Основной целью было дать читателю материал для сопоставления механизмов и возможностей статической и динамической устойчивости. К рассмотрению последней мы переходим в следующем разделе.