Учитывая, что картофель поражается и другими бактериальными возбудителями, изоляцию бактерий следует проводить из образцов картофеля со следующими признаками поражения: листья увядшие, стебли с бурыми штрихами или полностью побуревшие, часто с изломом, при разрезе стебля обнаруживается либо полость, либо выделяется грязно-бурая масса бактериального экссудата. При погружении свежесобранного стебля в мензурку с чистой водой через несколько минут видны треки, образуемые вытекающей из сосудов бактериальной массой. Предварительный анализ можно провести как с помощью микроскопических исследований, так и путем постановки ферментативных тестов.

1. Микроскопический анализ

Готовят тонкие срезы из пораженных стеблей и помещают их на заранее приготовленное предметное стекло в каплю стерильной воды, выдерживают 5-10 минут и просматривают под световым микроскопом в висячей или раздавленной капле с сухими системами при увеличении 5 х 8. Такое увеличение достаточно для рассмотрения потока бактерий, вытекающих из сосудов.

2. Постановка ферментативных тестов

В качестве экспресс-методов анализа пораженного растительного материала можно рекомендовать постановку реакций для определения оксидазы и уреазы.

Тест на оксидазу. В поперечный разрез стебля или клубня в области сосудистого кольца помещают фильтровальную бумагу, пропитанную, 1 %-ным раствором тетраметил-парафенилендиамина и прижимают её к срезу. Через 30-60 секунд в случае положительного ответа появляется красноватое или пурпурное окрашивание. Для постановки этой реакции можно использовать также диметил-парафенилендиамин. Раствор реактива нестоек, его следует применять свежеприготовленным.

Тест на уреазу. Небольшое количество растительного материала помещают в пробирку с питательной средой, содержащей мочевину. Засеянные пробирки ставят в термостат на ночь при температуре 28-30 °С. Состав среды, г/л: мясопептонный бульон – литр, мочевина – 20; 1,6 %-ный спиртовой раствор крезолового красного – 2 мл (рН 6,8-7,0). Мочевина стерилизуется отдельно фильтрованием в виде 20 % раствора и добавляется в МПБ перед посевом (на 100 мл среды 2 мл раствора мочевины). Для упрощения работы можно добавить мочевину в заранее простерилизованный бульон (30 минут, 1 атм.), среду разлить в пробирки по 5-6 мл и вновь простерилизовать под паром 10-15 минут. Количество мочевины можно снизить до 1 %. Положительная реакция на уреазу регистрируется покраснением среды.

Эти тесты служат для различия P. solanacearum от Corynebacterium sepedonicum – возбудителя кольцевой гнили, который не имеет ни оксидазы, ни уреазы. Возбудитель бурой гнили, напротив, обладает этими ферментами.

3. Выделение возбудителя

3.1. Выделение возбудителя из растительного материала

Анализ растительного материала лучше проводить в начальный период появления болезни, когда вторичные микроорганизмы еще не получили значительного развития. Кроме того, для выделения следует использовать еще не совсем увядшие растения, а достаточно крепкие, из которых возбудитель изолируется легче. Для анализа берут стебель, предварительно удалив листья и корни, тщательно промывают его водопроводной водой, затем разрезают на сегменты (3-5 см), с которых осторожно стерильным скальпелем снимают эпидермис. Если эпидермис снять сложно, то кусочки стебля необходимо простерилизовать сначала в 70 % этаноле, затем в 1 % растворе гипохлорита натрия (3 мин.) и промыть дважды в стерильной воде. Выделение возбудителя можно проводить различными методами.

3.1.1. Простерилизованные кусочки стебля разрезают на отрезки около 1 см и помещают в пробирки со стерильной водой на 30 минут, периодически их встряхивая. Затем берут каплю суспензии и высевают на питательные среды общепринятыми методами.

3.1.2. Кусочки помещают в стерильные ступки в небольшое количество стерильной воды, тщательно растирают пестиком до кашицеобразного состояния и переносят пестиком часть материала на питательные среды. Посеянный материал растирают шпателем на ряд последовательных чашек.

3.1.3. Кусочки стебля раскладывают на ещё теплый, но уже затвердевший агар и выдерживают под включенной лампой 4-6 часов для дальнейшего просмотра под лупой или малым увеличением микроскопа. На срезах стебля при наличии возбудителя выступают капли бактериального экссудата, который осторожно снимают и высевают на питательные среды.

3.2. Выделение возбудителя из клубней

Клубни картофеля тщательно промывают водопроводной водой, а затем последовательно стерилизуют сначала 1 %-ным раствором гипохлорита натрия, потом 70 % этанолом и обжигают над пламенем горелки. Клубни разрезают на небольшие кусочки, захватывая сосудистое кольцо, и помещают их в пробирки с питательной средой следующего состава: гидролизат казеина – 1 г, пептон – 10 г, глюкоза – 5 г, вода – 1 литр. Пробирки выдерживают в термостате 48 часов, после чего из них берут суспензию и высевают на среду Кельмана с ТТХ (состав ниже).