1. Подготовка инокулюма.

Для заражения растений в условиях лаборатории или теплицы используют бактериальные культуры, выращенные как на плотных, так и на жидких средах. Для заражения растений в полевых условиях для оценки устойчивости сортов и отбора более вирулентных изолятов используют чаще жидкие культуры или культуры, пoлученные после лиофилизации на определенных защитных средах с последующей регидратацией их в воде перед постановкой опытов.

1.1. Среды для выращивания бактерий

В качестве питательных сред для выращивания можно попользовать следующие среды: агаровые плотные среды для косячков – среда Кельмана без ТТХ (8.1), картофельный агар без г/в (8.2), среда ПД (8.3) и среда ПСА (8.4). В качестве жидких питательных сред используют все выше перечисленные среды без агара, а также среду следующего состава, г/л: меласса – 20, кукурузный экстракт – 15 (рН 7,0-7,2).

Для лиофилизации культур используют следующую среду: г/л, сахароза – 20, магний сернокислый – 4, калий фосфорнокислый однозамещенный – 3, натрий фосфорнокислый двухзамещенный – 6, желатин – 4.

1.2. Метод выращивания

Культуру на косячках выращивают общепринятыми способами при температуре 28 °С в течение 48 часов.

Жидкую культуру выращивают в колбах Эрленмейера на качалках. Режим культивирования: температура 28±1°С, скорость вращения 160 мин^-1, время инкубации 24-48 часов.

Концентрация суспензии млрд. клеток/мл определяется или по оптическому стандарту мутности, или с помощью фотоэлектроколориметра. ОД_600нм =0,6 соответствует млрд. клеток/мл.

2. Предварительная оценка патогенных свойств

2.1. Постановка реакции сверхчувствительности

Традиционным методом в фитобактериологии для первичного отбора патогенных изолятов является тест на проявление реакции сверхчувствительности (РСЧ) при введении клеток изучаемого изолята в ткань листовой пластинки табака или герани. Суспензию бактерий вводят в межклеточное пространство листа с нижней стороны. Обычно эту операцию осуществляют шприцом на 1 или 2 мл. Для контроля используют стерильную дистиллированную воду. Результаты учитывают через 24, 48 и 72 часа. Положительный результат: хлороз, некроз, искривление листовой пластинки или образование влажнопросвечивающих пятен.

Характер и время возникновения РСЧ позволяет не только провести отбор патогенных изолятов, но и осуществить предварительный отбор и дифференциацию среди штаммов P. solanacearum на расы 1 и 3. Табак, будучи растением-хозяином для расы 1, вызывает полный вилт растения через 7-8 дней. Сначала на листьях табака появляются темно-коричневые с темной каймой некротические пятна (не ранее чем через 36 часов после введения суспензии), спустя 60 часов происходит инвазия возбудителя в сосудистую систему с последующей гибелью растения. Изоляты расы 3 вызывают медленно протекающий хлороз через 2-8 дней. При постановке РСЧ на растениях комнатной герани при положительном результате образуются некротические пятна.

2.2. Метод заражения срезанных побегов картофеля

Свежесрезанные побеги картофеля погружают в бактериальную суспензию концентрацией 100 млн.-млрд. клеток/мл и выдерживают в течение суток. Положительный результат: хлороз и увядание листьев, хлороз и увядание нижних листьев, верхние листья утратили тургор и имеют вид "обваренных", увядание всего побега.

3. Проверка патогенности в тепличных условиях

Оценка патогенности выделенных бактериальных изолятов далее проводиться на растениях-хозяевах: для расы 1 – картофель, томаты, перец и баклажаны, для расы 3 – картофель и томаты.

Для инокуляции используются 6-недельные растения перца, томата и баклажан и 4-х недельные растения картофеля, выращенные в вазонах или ящиках. Высота растений в этом возрасте обычно достигает 20 см. Для ускорения выращивания побегов картофеля при массовой проверке изолятов клубни проращивают в слое влажного торфа высотой не менее 10 см. Клубни укладывают на дно лотка, оставляя промежутки между ними около 3 см, и засыпают слоем увлажненного торфа. Проращивание проводят в теплице. Побеги с 5-8 листьями вырастают примерно черев 3-4 недели. При выращивании в почве используют смесь следующего состава: почва : торф : песок = 3 :1:1.

Инокуляцию растений можно проводить различными методами в зависимости от цели исследования.

3.1. Метод укола в стебель

Каплю суспензии исследуемого изолята (млрд. клеток/мл) помещают в пазуху второго или третьего листа от верхушки и прокалывают её препаравальной иглой так, чтобы проколоть поверхность стебля. Место укола прикрывают увлажненной ваткой. Вместо суспензии можно использовать мазок культуры. Учет результатов проводят через 7, 14, 28 дней.

3.2. Метод "зубочистки"

Бактериальную пасту с косячка снимают зубочисткой и вносят в стебель, предварительно надрезанный скальпелем, место надреза прикрывают ваткой. Учет результатов через 7, 14 и 28 дней. Положительный результат: увядание отдельных побегов или всего растения, потемнение стебля или распространяющиеся полосы вверх и вниз от места инокуляции.

3.3. Метод инъекции в стебель

Суспензию бактерий вводят шприцом в стебель в пазуху 2 или 3 листа. Место укола закрывают увлажненной ваткой. Учет результатов – через 7, 14 и 28 дней с положительным результатом, данным в разделе 3.2.

3.4. Метод обрезания молодых корней

Обрезают корни исследуемого растения на 1-2 см и помещают в бактериальную суспензию на 10 минут, после чего растения вновь высаживают в почву. Положительный результат: увядание растений.

4. Постановка опытов в полевых условиях.

Для полевых опытов используют штаммы, проверенные вышеописанными методами. Изучают: 1. Вирулентность различных патогенных изолятов. 2. Устойчивость сортов. 3. Определение расового состава популяции.

Чаще для этих целей применяют два метода заражения растений.

4.1. Метод инокуляции картофеля с повреждением корней

Растения инокулируют, когда их высота достигнет 20-30 см. Для этих целей боковые корни вдоль одной стороны растения перерезают ножом или лопатой и на поврежденные корни наносят 10 мл суспензии концентрацией 10 млн.-1 млрд. клеток/мл. Корни перед инокуляцией должны быть увлажнены. Учеты проводят в фазу смыкания ботвы, бутонизации-начала цветения, массового цветения и перед уборкой урожая.

Учитывая, что P. solanacearum в картофель проникает в период образования придаточных корней или через ранки, метод внесения патогена в почву без повреждения корней не обеспечивает успешного заражения растений.

В практике скрининга устойчивых сортообразцов картофеля иногда применяют метод подрезания корней с последующей пересадкой в почву.

4.2. Метод опрыскивания поврежденных растений (Gitaitis et al, 198 )

При массовых испытаниях часто применяют лиофилизированную культуру бактерий, которую регидратируют водой. Растения повреждают песком под давлением 550 кРа под углом 45°, а затем опрыскивают бактериальной суспензией.

5. Шкалы учета пораженности растений

5.1. Шкала (Chen et at, 1981)

0 – симптомы поражения отсутствуют,

1 – 1-15 % увядших листьев,

2 – 16-30 % увядших листьев,

3 – 31-60 % увядших листьев,

4 – более 60 % увядших побегов,

5 – увядание всего растения.

5.2. Шкала Кемпе-Секвейра (Kempe, Sequeira, 1983)

0 – симптомы отсутствуют,

1 – 1-25 % увядших листьев,

2 – 26-50 % увядших листьев,

3 – 51-75 % увядших листьев,

4 – 76-100 % увядших листьев.

5.3. Шкала Хе (Не et al, 1983)

1 – симптомы отсутствуют,

2 – увял инокулированный лист,

3 – 2-3 листа увяли,

4 – 4 или более листьев увяли,

5 – гибель растения.

При постановке опытов в тепличных и полевых условиях следует помнить, что развитие вилта в значительной степени зависит от температуры и влажности воздуха. Для расы 3 таковыми являются: температура – день 20-24°С, ночь – не ниже 14°С. Для расы 1 – выше на 3-5°С. Влажность – не ниже 60 %.

Оценку вирулентности штаммов проводят по степени развития болезни, которую учитывают обычным способом.

Развитие, или индекс болезни, отражает среднюю интенсивность поражения (для отдельного растения, сорта, участка или определенной территории) и выражается в процентах.

Развитие болезни вычисляют по формуле:

R = ( ?(a?b)/(N x K) ) x 100,

где R – развитие болезни в %,

?(a?b) – сумма произведений числа больных растений (a) на соответствующий им балл поражения (b),

N – общее количество просмотренных растений (здоровых и больных),

K – высший балл шкалы учета.

По степени развития болезни изоляты возбудителя бурой гнили разделяют на 3 категории:

1 – слабовирулентные – степень развития болезни до 30 %,

2 – средневирулентные – степень развития болезни выше 30 % до 70 %,

3 – сильновирулентные – степень развития болезни выше 70 %.

Для расчета этого показателя берется не менее 20 растений на каждый исследуемый изолят.

Для определения стабильности вирулентных свойств производят посев исследуемой культуры на среду 8.1 (среда Кельмана с ТТХ) один или два раза в год. Мутанты могут появляться из-за изменения рН, температуры и других факторов. При их появлении патогенность может меняться. При наличии на чашках 50 % мутантов и выше лучше приготовить новый вирулентный штамм.

Для оптимального поддержания исходных свойств возбудителя бурой гнили картофеля лучше их хранить под слоем стерильного парафинового масла или в стерильной водопроводной воде (Kelman, Jensen, 1951; Kelman, Person, 1961).