Возбудитель бурой гнили входит в состав семейства Pseudomonodaceae род Pseudomonas, в группу нефлуоресцируюших псевдомонад. Представители этой группы в отличие от флуоресцирующих псевдомонад не образуют флуоресцирующего пигмента, но накапливают в клетках гранулы поли-?-гидрооксимасляной кислоты, обеспечивающие при окрашивании клеток биполярное окрашивание.

1. Определение наличия поли-?-оксибутирата.

Возбудителя болезни выращивают на питательной среде с сахарозой. На обезжиренное стекло наносят каплю 24-часовой суспензии возбудителя и равномерно распределяют её по предметному стеклу. Высушивание мазка проводят на воздухе, после чего мазок фиксируют над пламенем горелки. Для этого стекло с мазком, обращенным кверху, проводят над пламенем горелки 3-4 раза. После охлаждения стекла на мазок наносят раствор судана В, который выдерживают для лучшего прокрашивания 10-15 минут. Остаток краски удаляют фильтровальной бумагой и оставляют мазок для просушивания при комнатной температуре. Затем промывают стекло водой и вновь подсушивают, после чего наносят 0,5 % водный раствор сафранина или разбавленного раствора карболового фуксина на 10 с и промывают водой. После подсушивания препарат просматривают в фазово-контрастном микроскопе под иммерсионным маслом. Гранулы поли-?-оксибутирата имеют голубовато-черный или голубовато-серый цвет.

Приготовление судана В. 0,3 г красителя растворяют в 100 мл 70 %-ного этилового спирта, тщательно встряхивают и оставляют на ночь, затем раствор фильтруют и краситель готов для применения.

Приготовление сафранина. 0,5 г сафранина растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Некоторые исследователи рекомендует для окраски гранул применять вместо судана В нильский голубой А, считая, что последний более пригоден для указанных целей.

Окраска нильским голубым. Фиксированный над пламенем препарат окрашивают 1 %-ным водным раствором нильского голубого. Через 10 минут препарат промывают водой и затем обрабатывают 8 %-ным водным раствором уксусной кислоты. При просмотре в люминисцентном микроскопе при длине волны 460 нм гранулы поли-?-оксибутирата имеют интенсивную оранжевую окраску (Ostle et al, 1982).

2. Тест на оксидазу.

На отрезок фильтровальной бумаги наносят несколько капель 1 %-ного раствора дихлорида тетраметил-п-фенилдиамина, приготовленного в тот же день. Выросшую культуру снимают с поверхности агаровой среды платиновой петлей (обычные петли из нихромовой проволоки могут давать ложноположительную реакцию) и наносят её на увлажненную бумагу. Положительная реакция: развитие фиолетовой или пурпурной окраски в течение 10 с.

Оксидазная реакция является дифференцирующим критерием многих фитопатогенных бактерий, особенно рода P. solanacearum. 1 группа фитопатогенных псевдомонад – P. syringae – оксидазоотрицательна, а в группе нефлуоресцирующих псевдомонад, в основном, оксидазоположительные виды, среди них и P. solanacearum.

При постановке теста на оксидазу важен выбор среды, на которой растет культура перед исследованием. Наличие высокого содержания в среде углеводов нежелательно. Иногда наблюдается задержка реакции на средах с 2 % глюкозы. Лучше культуру выращивать на средах, где уровень глюкозы не превышает 0,5 %.

3. Разложение нитратов до нитритов.

Изоляты P. solanacearum варьируют по способности образовывать нитриты. Картофельная раса 3 биотип 2 продуцирует нитриты из нитратов, а другие биотипы (3 и 4) и некоторые изоляты биотипа 1 образуют газ из нитратов, т.е. проходит процесс денитрификации.

Для постановки этого теста можно использовать различные среды с нитратом калия. Хорошие результаты дает следующая среда: г/л, пептон – 10, хлористый натрий – 5, нитрат калия – 2, агар – 3. Агар добавляется для получения полужидкой консистенции. Среду разливают в пробирки по 10 мл. Инокулят смешивают со средой осторожно, равномерно распределяя его по пробирке. Во время инкубации необходимо следить за появлением пузырьков газа, что является предварительным указанием на денитрификацию. Можно следить за процессом денитрификации в варианте пробирок, поверхность среды в которых закрыта 3 мл 3 % агара. Образование нитритов устанавливают с помощью реактива Грисса – красная окраска среды свидетельствует о редукции нитратов. Образование нитритов определяют через 3, 5, 7 дней после инокуляции (1 мл реактива Грисса на пробирку среды). Если красная окраска в среде не появляется в течение часа, то в пробирку добавляют небольшое количество цинковой пыли. Появление красной окраски в среде указывает, что нитрат в среде не восстановился, и добавление цинка привело к его химическому восстановлению. Отсутствие окраски означает, что организм восстановил весь нитрит и произошла денитрификация.

Другим способом учета процесса нитифнкации или денитрификации может служит использование жидких сред с нитратом калия и помещение поплавков в пробирки (дном вверх). В качестве среды можно использовать МПБ с 1 % KNO₃.

Реактив Грисса.

Реактив состоит из следующих 2 растворов.

1. Раствор сульфаниловой кислоты: 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 30 % уксусной кислоты (уд. вес 1,04).

2. Раствор ?-нафтиламина. 0,2 г ?-нафтиламина нагревают в 20 мл дистиллированной воды, не доводя до кипения, раствор фильтруют через хлопчатобумажную ткань. Перед употреблением растворы смешивают.

4. Толерантность к хлористому натрию.

Возбудитель бурой гнили картофеля необычно чувствителен к содержанию этой соли в среде. Обычно виды рода Pseudomonas растут при содержании соли в среде 3 %, а иногда и выше, а изоляты P. solanacearum – не более 2 %. Задержка роста наблюдается у отдельных штаммов и при концентрации 1 %. Для постановки этого теста можно использовать различные среды: картофельный агар без генциан-виолета, Кельмана без ТТХ, пептонно-дрожжевая, сахарозо-пептонная. Часто используют среду следующего состава, г/л: пептон – 5, дрожжевой экстракт – 3, глюкоза – 5, агар – 20. Во все вышеуказанные среды добавляется хлористый натрий в различных концентрациях от 0,5 до 6 %.

5. Образование меланина.

Многие фитопатогенные бактерии при росте на питательных средах выделяют пигменты. Способность к образованию пигментов детерминирована генетически и поэтому может использоваться в качестве характерного признака. P. solanacearum не имеет флуоресцирующих, феназиновых и каротиноидных пигментов, но образует темный диффузный пигмент различной интенсивности. Образование темно-коричневого или интенсивно черного пигмента наблюдается и на стерильных ломтиках картофеля, но более стабильные результаты регистрируются на питательных средах с L-тирозином (предшественник меланина). Состав питательных сред с тирозином приведен в разделе 8.5. Для этих целей можно использовать и жидкие среды, например, МПБ или триптофановый бульон.

6. Отношение к температуре.

Широкий диапазон температур был установлен для P. solanacearum. Картофельная раса 1 лучше растет при 35-37°С, а раса 3 имеет оптимум 27-28°С. Для постановки данного теста штаммы возбудителя выращивают на косяках агара при различных температурах от 5 до 41°С.

7. Тест на аргининдигидролазу.

Наличие аргининдигидролазной системы позволяет некоторым псевдомонадам расти при анаэробных условиях. Система содержит два энзима: аргининдезаминазу, разлагающую аргинин до цитруллина и аммиака, и цитруллинуредазу, превращающую цитруллин в орнитин + углекислый газ + аммиак. Для постановки этого теста инокулируют полужидкую среду Торнли, содержащую аргинин, а также контрольную среду без аргинина. После посева в столбик среду герметично покрывают стерильным вазелиновым маслом и инкубируют. Положительная реакция: изменение окраски от желто-оранжевой до красной в течение 7 дней. Состав среды, г/л: пептон – 1, хлористый натрий – 5, калий фосфорнокислый двухзамещенный – 0,3, феноловый красный – 0,01, L-аргинин НС1 – 10, агар – 3 (рН 7,2).

7. Тест на уреазу.

Инокулируют скошенный агар Кристенсена с мочевиной и инкубируют. Положительный результат: появление красно-фиолетовой окраски.

8. Тест на липазу.

Липолитическую активность определяют на среде, содержащей твины, г/л: пептон – 10, хлористый натрий – 5, хлористый кальций – 0,1, агар – 20, твин – 10 мл. Твины (20, 40, 60, 80) стерилизуют отдельно и затем добавляют в основную среду. Положительный результат: образование маслянистого блестящего с переливами или перламутрового слоя над колонией и вокруг нее на поверхности агара. При исследовании под микроскопом видно, что мутный ореол вокруг колонии состоит из кристаллов кальциевого мыла.

9. Воздействие на молоко.

Инокулируют пробирку с лакмусовым молоком. Реакция культур может быть различной.

Подкисление: появление розовой окраски.

Подщелачивание: появление синей окраски.

Восстановление лакмуса: молоко становится белым за счет обесцвечивания лакмуса, обычно это происходит в нижней части пробирки.

Кислый творожистый осадок: твердый розовый сгусток, растворимый в щелочи, не сжимается.

Творожистый осадок сычужного типа: мягкий нерастворимый в щелочи сгусток, при сжатии которого отделяется сероватая сыворотка.

Пептонизация (протеолиз): молоко становится полупрозрачным в результате гидролиза протеина (казеина), начинающегося чаще в верней части столбика среды. Среда чаще становится щелочной.

10. Гидролиз желатины

Используют МПБ, содержащий 12 % желатины. Засеянные пробирки инкубируют при температуре 20°С в течение 6 недель. Положительная реакция: разжижение по крайней мере части среды.

11. Определение флуоресцирующего пигмента.

Фитопатогенные псевдомонады делятся на 2 группы: флуоресцирующие и нефлуоресцирущие. P. solanacearum входит во вторую группу. Для обнаружении флуоресценции чаще используют среду Кинга В, г/л: пептон – 20, калий фосфорнокислый двухзамещенный – 1,5, магний сернокислый – 1,5, глицерин – 10 мл, агар – 20.

Положительная реакция: флуоресцирующая зона на агаре вокруг участка роста культуры.

12. Определение биотипов P. solanacearum.

У P. solanacearum описано 5 биохимических групп. Представители расы 1, 2 и 4 относятся к биотипам 1, 3 и 4, расы 3 – к биотипу 2, а штаммы, выделенные из шелковицы, к биотипу 5. Для определения биотипов Хауворд использовал тесты, определяющие способность окислять дисахариды – целлобиозу, лактозу и мальтозу и многоатомные спирты – манит, сорбит и дульцит.

Для этого бактерии выращивают на среде следующего состава, г/л: аммоний фосфорнокислый однозамещенный – 1,0, хлористый калий – 0,2, магний сернокислый – 0,2, пептон – 1,0, бромтимол блау (1 %-ный водный раствор) – 3 мл, агар – 1,5. Пептон в среде может быть заменен дрожжевым экстрактом. Углеводы стерилизуются отдельно в виде 10 % растворов. Глюкоза, маннит, сорбит и дульцит довольно устойчивы к нагреванию и могут быть простерилизованы при 110°С 20 мин (0,5 атм.). Другие углеводы термолабильны и могут разрушаться при нагревании. Их стерилизуют фильтрованием через мембранные фильтры или через фильтр Зейтца.

Дульцит плохо растворим в воде при 20-30°С, поэтому раствор этого спирта нагревают в водяной бане, охлаждают и доливают до нужного объема. При постановке тестов основную среду расплавляют, охлаждают до 50-60°С и добавляют углеводы в окончательной концентрации 1 %, т.е. 10 мл 10 % раствора сахара к 90 мл среды или 2 мл к 18 мл основной среды.

Для постановки этого теста можно также использовать обычную пептонную воду с реактивом Андреде. Состав пептонной воды: пептон – 10 г, хлористый натрий – 5 г, углеводы – 10 г (добавляются также, как описано выше) на 1 л воды. Индикатор Андреде: 0,5 г кислого фуксина растворяют в 100 мл дистиллированной воды и добавляют 16,4 мл нормального раствора едкого натрия, стерилизуют 5 мин при 110°С и сохраняют в темных склянках. К среде добавляют 1 % индикатора Андреде. Среда после добавления индикатора должна быть бесцветной или иметь слабый соломенно-желтый цвет. В кислой среде индикатор краснеет.

Учет проводят ежедневно, окончательно через 3-4 недели.

К биотипу 1 относят изоляты, не дающие ни кислоты, ни газа на всех 6 углеводах.

К биотипу 2 – изоляты, окисляющие дисахариды, но не окисляющие спирты.

К биотипу 3 – изоляты, окисляющие и спирты и дисахариды.

К биотипу 4 – изоляты, окисляющие спирты, но не дисахариды.

К биотипу 5 – изоляты, окисляющие мальтозу, лактозу, целлобиозу и маннит, но не дульцит и сорбит.

Следует помнить, что при постановке этих тестов при использовании индикатора бромтимол блау при подкислении цвет среды становится желтым, а при применении индикатора Андреде – цвет среды становится красным.

При использовании в первой среде в качестве источника углеводов глюкозы можно определить тип дыхания: окислительный или ферментативный. Для этих целей одну из пробирок после внесения инокулюма заливают слоем расплавленного парафина или 3 % агаром (слой толщиной 2 см). Строгие или факультативные анаэробы кислоту образуют в обеих пробирках, окислительный тип реакции протекает только в открытой пробирке. Реакция ферментации протекает с выделением газа или без выделения, о чем можно судить по пузырькам газа или поднятию агара вверх. P. solanacearum имеет окислительный тип дыхания.

13. Определение подвижности бактериальных клеток.

Клетки P. solanacearum вирулентные при просмотре под микроскопом подвижные, авирулентные – неподвижные при постановке теста на среде следующего состава, г/л: триптон – 0,1, глицерин – 0,1 мл, фосфатный буфер (рН 7,0) – 10 мл (фосфорнокислый калий однозамещенный 117,7 г, фосфорнокислый калий двухзамещенный – 44,1 г, вода 1 л), агар – 3,5.

ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех средах, приведенных в разделах 8 и 10, рН среды 6,8-7,2.

14. Определение характера жгутикования клеток.

Учитывая, что возбудитель бурой гнили картофеля имеет характерные морфологические отличия от возбудителей других бактериозов картофеля, а именно один полярный жгутик, можно использовать этот диагностический тест для отличия его от возбудителя черной ножки (перитрихиальное жгутикование) и кольцевой гнили (вообще не имеет жгутиков). Изучение жгутикования, установление формы и размера клетки лучше проводить при исследовании приготовленных препаратов под электронным микроскопом.

Для этих целей готовят бактериальную суспензию из односуточной культуры концентрацией не более млрд. клеток/мл и наносят на формваровую или коллодиевую пленку-подложку. Коллодиевую пленку получают на поверхности воды путем нанесения капли 1,0-1,5 % раствора коллодия с последующим помещением на нее суспензии бактерий. Далее с помощью пинцета под участки пленки подводят сетки, которые легко прилипают к пленке, и затем осторожно извлекают их из воды.

Формваровую пленку готовят следующим образом: в 0,1 % раствор формвара в хлороформе, находящемся в высоком цилиндре, погружают стекло на 1-2 мин для получения пленки. Затем стекло приподнимают над поверхностью раствора и высушивают в парах хлороформа в течение 5 мин. Затем стекло досушивают на воздухе и по краям бритвой делают надрезы и опускают в воду, налитую в кристаллизатор. При этом пленка отделяется от стекла и всплывает. Затем на поверхность пленки осторожно наносят сеточки, на которые помещают фильтровальную мелкопористую бумагу, к которой сразу же прилипают сетки с пленкой. Затем фильтр осторожно вытаскивают из воды так, чтобы пленка с сетками при этом не сморщилась, и выкладывают в чашки Петри сетками вверх. После подсыхания сетки готовы для использования. Сетки с нанесенными на них суспензией бактерий высушивают, промывают в бидистилляте и затем снова высушивают. Контрастирование проводят 1 %-ным раствором уранилацетата.