Теоретическим обоснованием для разработки метода отбора стабильных рас гриба послужило вегетативное обособление генетически однородных ядер в гифах и конидиях гетерокариотичных грибов.

В основу отбора клоновых культур возбудителя фитофтороза картофеля положен метод последовательного моноконидиального, монозооспорового, моногифального анализа или их сочетание.

Исходным материалом для отбора клоновых культур служат изоляты гриба различного географического происхождения.

Отбор клоновых культур проводят по двум основным признакам вирулентности и морфолого-культуральным свойствам колонии и в такой последовательности.

 

Вирулентность исходного изолята определяют по международной схеме (приложение 2) на тест-наборах растений-дифференциаторов Шика и Блэка, а также на дополнительном наборе культурных сортов картофеля (приложение 3) или сортах, имеющихся в учреждении, обладающих определенными генами устойчивости (для всех последующих этапов работ). Растения-дифференциаторы и культурные сорта картофеля выращивают в теплице при температуре 21-24°С. С этой целью в начале февраля замачивают семена растений-дифференциаторов Шика и проращивают их на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри. При появлении семядольных листочков проростки высаживают в глиняные горшки (диаметр горшков 16-17 см), содержащие смесь дерновой почвы и перегноя в соотношении 1:1. Такой почвой набивают горшок на 2/3 его высоты. Сверху насыпают чистый перегной слоем 2-3 см.

Для лучшей приживаемости сеянцы прикрывают на неделю стеклянным сосудом. За сеянцами систематически ухаживают: ежедневно поливают, подкармливают один раз в 20 дней полным минеральным удобрением (из расчета 20 г минерального удобрения на 10 л воды); рыхлят почву.

Клубни растения-дифференциатора Блэка и картофель культурных сортов высаживают в начале марта. Клубни предварительно проращивают на свету и высаживают в глиняные горшки с почвой (диаметр горшков 25 см). Уход за растениями тот же, что и за сеянцами растений-дифференциаторов.

В начале мая листья растений-дифференциаторов и культурных сортов картофеля можно использовать для работы.

Изучение вирулентности штамма проводят в лабораторных условиях на долях листа, отделенных от растений. Для этой цели используют листья среднего яруса. Сбор листьев и их инокуляцию проводят во второй половине дня. Отделенные доли листа помещают во влажную камеру и раскладывают нижней стороной вверх. Влажная камера представляет собой деревянную рамку размером 30Х40 см, дно которой затянуто металлической (можно капроновой) сеткой с ячейками размером 1-2 мм. Для создания влажной камеры рамку помещают на слой влажной фильтровальной бумаги, которая постоянно увлажняется. Сверху камеру покрывают стеклом, плотно прилегающим к рамке. В такую камеру одновременно помещают по три листа каждого растения-дифференциатора. Листья культурных сортов картофеля помещают в другую камеру.

В качестве влажной камеры можно использовать чашки Петри, содержащие увлажненную фильтровальную бумагу. В этом случае в чашку Петри помещают по три листочка одного растения.

Для инокуляции листьев используют 4-5-дневную культуру, выращенную на ломтиках клубней восприимчивых сортов картофеля, не обладающих генами устойчивости. Ломтики клубня инокулируют 10-12-дневной культурой, выращенной на косяках ржаной или овсяной среды. При длительном культивировании гриба на питательной среде ослабляется его агрессивность, поэтому такую культуру необходимо предварительно неоднократно реизолировать с листьев восприимчивого сорта картофеля без R-генов с последующими пересевами на ломтики клубня. Из культуры гриба, выращенной на ломтиках клубней восприимчивого сорта, в дистиллированной или водопроводной воде готовят суспензию из расчета 25-30 конидий в поле зрения микроскопа при увеличении 100Х. С этой целью мицелий гриба снимают с ломтика с помощью глазного скальпеля и помещают в пробирку, содержащую 5-7 мл воды. Пробирку встряхивают для отделения конидий от мицелия. Суспензию конидий помещают в холодильник на 1-2 часа при температуре 10-12°С для выхода зооспор. С помощью пастеровской пипетки на нижнюю поверхность листа наносят по две капли суспензии зооспор гриба. Инокулируют по два листа каждого растения, один лист не инокулируют, оставляют для контроля.

Через сутки после инокуляции капли суспензии гриба стряхивают, а листья переворачивают верхней стороной. Зараженные листья инкубируют при оптимальной температуре 19-21°С.

Поражение листьев растений-дифференциаторов учитывают на 4-6-й день, на культурных сортах — на 3-5-й день. Наличие спороношения гриба на листьях указывает на положительную реакцию, отсутствие спороношения — на отрицательную. Положительную реакцию отмечают знаком +, отрицательную — знаком 0.