Метод верхушечной меристемы основан на выращивании растений из апикальных зон делящихся клеток, выделенных из ростков клубней картофеля, размером 100-200 мк.

Питательные среды для выращивания растений из меристемы. В качестве основных ингредиентов питательных сред используют мокро- и микросоли, витамины, органические вещества, регуляторы роста. Минеральный состав питательных сред должен обеспечивать сбалансированное и достаточное снабжение меристем необходимыми элементами питания. Для роста картофельных эксплантатов оптимальным является рН 5,7. При отклонениях рН необходимо довести до оптимума путем добавления 0,1 н КОН или 0,1 н HCl. Среда должна быть достаточно буферной, поскольку при культивировании меристем картофеля она будет подкисляться. Лучшей для культивирования меристем картофеля является среда с минеральной основой Мурасиге-Скуга.

Среда Мурасиге-Скуга, мг/л
Макросоли:			Микросоли:
NH4NO3	1650		H3BO3	6,2
KNO3	1900		MnSO4 x 4H2O	22,3
CaCl2 x 2H2O	440		ZnSO4 x 4H2O	8,6
MgSO4 x 7H2O	370		KJ	0,83
KH2PO4	170		CuSO4 x 5H2O	0,025
Na2ЭДТА	37,3		NaMoO4 x 2H2O	0,25
FeSO4 x 7H2O	27,8		CoCl2 x 6H2O	0,025
Витамины, мг/л
Мезоинозит	100		Сахароза	30 000
Никотиновая кислота	0,5		Гидролизат казеина	1000
Пиридоксин	0,5		Агар	10 000
Тиамин	0,1
Регуляторы роста:
ГК	1,0		Кинетин	0,01
ИУК	1,0

Из группы витаминов в среду добавляют пиридоксин (В₆) и В₁, аскорбиновую кислоту, биотин, мезоинозит, пантетенат Са, никотиновую кислоту (РP).

Необходимый компонент среды – сахароза – источник углеводного питания при выращивании меристем.

Положительное влияние на рост меристем оказывает добавление в среду источника аминокислот, например, гидролизата казеина.

Существенно улучшает рост меристем добавление в питательную среду регуляторов роста. Обычно в среды добавляют регулятора роста из группы ауксинов – веществ, продуцируемых растущими верхушками стеблей и корней (?-индолил-3-уксусная кислота – ИУК) или синтетические аналоги ауксина: индолил-масляная кислота (ИМK), ?-нафтилуксусная кислота (?-ИУК) и 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4 Д). Физиологическую активность в растениях ауксин, добавленный извне, проявляет в низких концентрациях (0,005-10,0 мг/л). Основное действие ИУК, как к других ауксинов, сказывается на ризогенезе и дальнейшем росте корней; обычно применяется концентрация 1-2 мг. Активный стимулятор корнеобразования – ИМК используется в концентрации 0,1-1,0 мг/л; ?-ИУК – в концентрации 0,5-1 мг/л является стимулятором каллусо- и корнеобразования.

В ауксиновом обмене в растениях участвуют фенольные соединения, стимулирующие рост, а также способствующие лигнификации: феруловая кислота, кониффиловый спирт, кофейная кислота.

Рост стеблей индуцируют гиббереллины. При опрыскивании проростка гиббереллином происходит вытягивание стеблей, но не увеличение числа междоузлий. Для гиббереллина характерно действие на клеточное деление в меристематических зонах, а не в дифференцированной ткани. Обычно применяется концентрация в питательных средах – 0,2 мг/л. Важным компонентом питательных сред являются цитокинины – фитогормоны, стимулирующие клеточное деление, способствующие дифференциации почек, вызывающие позеленение пожелтевших листьев, ингибирующие корнеобразование; применяемые концентрации – 0,02-0,1 мг/л.

Вычленение верхушечных меристем. Меристему вычленяют из зеленых или этиолированных ростков клубней. Вычленение меристемы из зеленых ростков технически проще, поскольку в них она хорошо различима и более устойчива к повреждению при вычленении. Однако эффективность оздоровления выше при использовании этиолированных ростков клубней, так как концентрация вирусов в таких ростках значительно ниже, и вероятно, зона верхушечной меристемы, свободная от вирусов, больше, чем в ростках, выросших на свету. После предварительного проращивания клубней, ростки длиной 2 см и более отрывают от клубня.

Работа по вычленению меристем проводится в простерилизованном с помощью ртутно-кварцевых или бактерицидных ламп типа БУВ в микробиологическом боксе. Перед началом работы рабочее место (стол, бинокулярная лупа) и штативы с пробирками протирают спиртом. Инструмент, используемый для вычленения (пинцеты, скальпели и иглы), стерилизуют перед каждым вычленением, погружая в спирт с последующим обжигом.

Для достижения лучшей стерильности используют ламинар-боксы типа КПГ-1.

Ростки перед вычленением меристем стерилизуют в 0,1 %-ном растворе диацида (смесь этанолмеркурхлорида и N-петилпиридиний хлорида). Раствор диацида готовят на бидистиллированной воде. Ростки опускают в химический стакан, наливают раствор диацида и стерилизуют 3-5 мин, затем трижды промывают в стерильной воде. Стерилизовать можно также в 1-6 %-ном растворе гипохлорида кальция или натрия или в 0,1 %-ном растворе сулемы.

Дезинфицированные ростки помещают в стерильную чашку Петри и добавляют несколько капель автоклавированной воды для предупреждения их подсыхания.

Перед вычленением с верхушки ростка удаляют верхние покровные листочки, последовательно обнажая боковые и верхушечные меристемы с примордиальными листочками. Эту операцию лучше проводить дисцизионной медицинской иглой под бинокулярным микроскопом с 24-кратным увеличением с масштабной сеткой. Меристему, включающую кусочек ткани размером 100-250 мк без листовых зачатков (примордиев), вычленяют обычной тонкой иглой, зажатой в цанговый держатель. Можно также использовать для этой цели специально заточенную диспизионную иглу или кусочек лезвия, зажатый в цанговый держатель. Вычленять можно как верхушечную, так и боковые меристемные точки роста. Каждую операцию по обрыванию листочков и вычленению меристемы проводят отдельным простерилизованным инструментом. После вычленения меристему на острие иглы переносят на поверхность питательной среды в пробирку. Затем пробирку закрывают пробкой над пламенем горелки и ставят в штатив. После заполнения штатив накрывают целлофановым колпачком для предупреждения чрезмерного подсыхания среды.

Регенерация растений из меристемы. Пробирку с посаженной на среду меристемой переносят в специальную камеру с постоянным режимом света, влаги и температуры. Обычно для создания такого режима используют помещения, оборудованные люминисцентными лампами с кондиционированием воздуха или специальными световыми устройствами для выращивания растений из верхушечных меристем (типа СУВР-Р, СВ-1Л, климатические камеры).

Температуру в камере поддерживают на уровне 24-25°, освещенность – 6-2 тыс. лк, фотопериод – 16 ч, влажность – около 70 %. Важным условием хорошей регенерации растений из меристем является сокращение периода между их выделением и помещением в камеру с постоянным режимом. Время от посадки меристем до регенерации растений с 5-6 листочками составляет 30-45 дней, однако некоторые меристемы могут оставаться живыми и регенерировать растение за 2-8 мес.

В течение периода регенерации проростки из меристем пересаживают на новую порцию той же среды или новую по составу среду.

Полученное растение с 5-6 листочками черенкуют и черенки высаживают в пробирки на питательную среду для получения растений. Одновременно проводят электронно-микроскопический контроль растений-регенерантов.

Для приготовления препаратов при первом и последующих черенкованиях отбирают один черенок с хорошо развитым листом из нижней части растения. Опыт работы говорит о том, что для получения достоверных результатов необходимо провести не менее чем трехкратную диагностику при последовательных черенкованиях по 2-4 препарата каждой раз. Хорошие результаты получены при использовании для контроля зараженности растений in vitro иммуноферментного анализа. Растения-регенеранты, содержащие вирусы, удаляют. Растения, не содержащие вирусных частиц, получают условное обозначение и размножаются черенкованием in vitro.