1. Ржано-овощная среда

 

Состав: сок овощной или томатный – 50 мл;

рожь – 100 г;

СаСО₃ – 5 г;

сахароза – 5 г;

агар-агар – 17 г;

вода дистиллированная – 950 мл.

Приготовление среды: 100 г ржи помещают в колбу из термостойкого стекла, заливают 500 мл дистиллированной воды, запаривают в автоклаве под текучим паром при 0,5 атм. 50 мин. После охлаждения содержимое колбы фильтруют через два слоя марли. В 450 мл дистиллированной воды расплавляют 17 г агар-агара в водяной бане, затем смешивают ржаную вытяжку с отфильтрованным агаром, добавляют сок, сахарозу и СаСО₃ и доводят объем среда до 1 л дистиллированной водой. Среду разливают в колбы и стерилизуют в автоклава при 1 атм 40 мин.

 

 

2. Овощная среда

Состав: сок овощной или томатный – 100 мл;

СаСО₃ –5 г;

агар-агар – 17 г;

вода дистиллированная – 900 мл.

Приготовление среды: 17 г агар-агара заливают 900 мл дистиллированной воды, расплавляют в водяной бане, затем фильтруют через два слоя марли и добавляют сок, СаСО₃. Готовую смесь тщательно перемешивают, доводят объем среды до 1 л дистиллированной водой, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 40 мин.

 

3. Овсяная среда

 

Вариант 1.

Состав: овсяная крупа – 100 г;

агар-агар – 17 г;

дистиллированная вода – 1000 мл.

Приготовление: 100 г овсяной крупы (или 50 г овсяных хлопьев) заливают 600 мл дистиллированной воды, помещают в водяную баню и выдерживают 40 мин (с момента закипания), затем фильтруют через два слоя марли. На водяной бане в 400 мл дистиллированной воды расплавляют 17 г агар-агара, после чего овсяную вытяжку смешивают с отфильтрованным агаром, доводят объем среды до 1 л, разливают в колбы или в биологические пробирки (по 20 мл в каждую) и стерилизуют 40 минут при давлении пара в 1 атм. После стерилизации среду скашивают, размещая пробирки под углом 35-40° так, чтобы верхний уровень среды не касался пробки.

 

Вариант 2.

Состав: овсяные хлопья – 100 г;

агар-агар – 10 г;

дистиллированная вода – 1000 мл.

Приготовление: 100 г овсяных хлопьев в течение 20 минут варят в литре дистиллированной воды, полученную массу фильтруют через слой марли, в фильтрат добавляют 10 г агара и доводят до литра. Среду разливают в пробирки. Режим стерилизации: 1 атм. 40 минут.

 

4. Ржаная среда

 

Состав: рожь – 100 г,

сахароза – 5 г,

агар-агар – 17 г,

вода дистиллированная – 1000 мл.

Среду готовят так же, как и ржано-овощную, но без добавления сока и СаСО₃.

5. Приготовление ржаной среды по Кейтену

 

60 г семян ржи заливают одним литром дистиллированной воды и оставляют на 36 часов. Через 36 часов фильтрат сливают и сохраняют. Разбухшие семена ржи заливают свежей порцией дистиллированной воды (300-400 мл), и эту массу кипятят на слабом огне 1 час с момента закипания. За 15 минут до окончания кипячения добавляют 15 г агара. Полученную массу фильтруют через несколько слоев марли и осадок выбрасывают. К фильтрату добавляют исходную жидкость, полученную после замачивания семян ржи, 20 г сахарозы и фильтрат доводят до одного литра дистиллированной водой. Подготовленную среду разливают в пробирки и автоклавируют при 1 атм. 40 минут.

 

6. Состав среды Фриза

 

C₄H₄OKNa х 4H₂O – 5 г

Глюкоза – 20 г

Пептон – 2,62 г

MgSO₄ х 7H₂O – 0,5 г

NaCl₂ – 0,1 г

CaCl₂ – 0,1 г

FeCl₂ – 10 капель (1%-ный раствор)

Витамин В₆ – 5 ?

Агар – 15 г

Дистиллированная вода – до 1 л

Режим стерилизации: 0,5 атм. 40 минут

 

7. Среда для культивирования конидий возбудителя фитофтороза картофеля.

 

Для массового выращивания инфекции можно использовать стерильные зерна ржи (Тверской и др., 1981). Зерна перебирают, чтобы освободить их от шелухи и больных, затем тщательно моют в теплой воде и высушивают. Высушенное зерно засыпают по 50 г в колбы емкостью 500 мл и заливают 100 мл водопроводной воды. Затем колбы закрывают пробками, завязывают и автоклавируют в течение 30 мин при давлении 1,5 атм.

Посев гриба на стерильную рожь осуществляется следующим образом: в колбу с зерном заливают суспензию, приготовленную из содержимого пробирок. В пробирку с культурой гриба наливают стерильную дистиллированную воду, тщательно встряхивают, после чего ее содержимое (суспензию) выливают в колбу с зерном. На каждую колбу требуется одна пробирка десятидневной культуры гриба. Колбы с посевом культуры хранят при температуре 18-19 °С.

Хороший рост гриба отмечается на 7-10-й день после посева. Для приготовления суспензии в колбу с культурой наливают дистиллированную воду, встряхиванием колбы добиваются отделения конидий от конидиеносцев, затем суспензию просматривают под микроскопом для подсчета инфекционной нагрузки.

 

8. Агаровая среда

 

Состав: агар-агар – 15-20 г,

вода дистиллированная – 1000 мл.

Приготовление среды: к 1 л воды добавляют 15-20 г агар-агара, растворяют при нагревании и стерилизуют 30 мин при давлении пара в 1 атм.

 

9. Картофельно-сахарозный агар

 

Состав: картофель – 200 г.;

сахароза – 20 г;

агар-агар – 20 г;

вода дистиллированная – 1000 мл.

Приготовление среды: 200 г картофеля сварить и отфильтровать через марлю, к отвару добавить 20 г сахарозы и 20 г агар-агара, растворяя их при нагревании. Стерилизация – в автоклаве 30 мин. при 1 атм.

 

10. Картофельно-декстрозный агар

 

Состав: картофель – 200 г;

декстроза – 20 г;

агар-агар – 20 г;

вода дистиллированная – 1000 мл.

Среду готовят так же, как и картофельно-сахарозный агар, но вместо сахарозы добавляют декстрозу.

 

11. Картофельно-глюкозный агар (КГА)

 

Состав: картофель – 400 г;

глюкоза – 20 г;

агар – 20 г;

дистиллированная вода – 1 л.

Приготовление среды: 200 г очищенного картофеля варят в дистиллированной воде. Затем полученный бульон фильтруют через марлю, добавляют 20 г глюкозы, доводят рН до нужного значения и смешивают с агаром. Среду переливают в колбу объемом 2 л, закрывают ватно-марлевой пробкой или фольгой и автоклавируют при давлении 1,5 атм. в течение 30-40 минут.

 

12. Картофельный агар

 

Состав: картофель – 200 г.;

агар-агар – 20 г;

вода дистиллированная – 1000 мл.

Среду готовят так же, как и картофельно-сахарозный агар, но без добавления сахарозы.

 

13. Сусло-агар

 

Состав: агар-агар – 20 г;

пивное сусло (7 %-ное) – 1000 мл.

Приготовление среды: к 1 л неохмеленного 7 %-ного пивного сусла (вместо воды) прибавляют 20 г агар-агара, растворяют при нагревании. Стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин.

 

14. Среда Чапека с крахмалом

 

Состав: крахмал растворимый – 30,0 г;

NaNO₃ – 2,0 г;

K₂HPO₄ – 1,0 г;

MgSO₄х7H₂O – 0,5 г;

KCl – 0,5 г;

FeSO₄ – 0,01 г;

агар – 20,0 г;

дистиллированная вода – 1 л.

Приготовление среды: навески компоненты добавляют в дистиллированную воду и смешивают с агаром. Среду переливают в колбу объемом 2 л и на водяной бане разогревают до растворения крахмала и агара (периодически помешивая), закрывают ватно-марлевой пробкой или фольгой и автоклавируют при давлении 1,5 атм. в течение 30-40 минут.

 

15. Среда Кельмана (Kelman, 1954)

 

Эта среда используется главным образом для выделения P. solanacearum из растительного материала. Добавление в эту среду 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ) делает её пригодной и для выделения из почвы, но чувствительность её в этом случае не очень высокая (млн. клеток/мл) из-за недостаточной селективности. Состав среды: г/л, глюкоза – 5, пептон – 10, гидролизат казеина – 1, 1 %-ный водный раствор ТТХ – 5 мл. ТТХ стерилизуется отдельно в виде 10 % раствора (5 мин. 1 атм.) и добавляется в среду перед посевом (в расплавленный и остуженный до 40-50° агар). Глюкоза в среде может быть заменена глицерином.

Колонии P. solanacearum на этой среде имеют следующий вид: кремово-белые, слизистые, растекающиеся со слабо приподнятым розоватым центром (окраска может быть ярче – до оранжево-красной) и большими белыми краями. Колонии редко бывают правильной формы, гораздо чаще имеют неровные края, а розовый центр имеет окраску по спирали. Такой вид колоний характерен для вирулентных форм. Невирулентные формы на этой среде маслянистые, кремово-белые в начале развития, затем красные с небольшими голубоватыми краями.

Для выделения из растительного материала возбудителя бурой гнили можно использовать также обычные питательные среды, применяемые для выделения грамотрицательных фитопатогенных бактерий, а именно: картофельный агар с генциан-виолетом, пептонно-дрожжевую и сахарозо-пептонную среды, а также среды с 1-тирозином.

 

16. Картофельный агар с генциан-виолетом

 

На 1 литр дистиллированной воды берут 200 грамм картофеля, очищенного и мелко нарезанного, и кипятят 20 мин., бульон отфильтровывают через два слоя марли и доводят объем до первоначального. Добавляют 20 г агара, расплавляют, вновь фильтруют и после этого вносят в среду 3 мл 0,1 % раствора генциан-виолета.