С.Ф. Коваль, В.П. Шаманин  "Растение в опыте"

 

По догме В. Иоганзена чистая линия, являющаяся потомством одного гомозиготного растения, состоит из генетически тождественных организмов. Всю наблюдаемую нами внутрилинейную дисперсию признаков принято считать паратипической, т.е. зависящей только от экологической пестроты поля и условий формирования семян внутри соцветия. Генетическая однородность делает чистые линии весьма привлекательными объектами для любых исследований. Линейность создается принудительным самоопылением под изоляторами в течении многих поколений с выращиванием потомства одного растения. Чистые линии перекрестноопыляющихся растений (кукуруза, рожь, свекла, клевер, люцерна, морковь, тыквенные и др.) очень часто имеют низкую силу роста, слабую устойчивость к экологическим стрессам, малопродуктивны и на них трудно изучать вопросы, связанные с адаптацией растения. В качестве меры повышения жизнеспособности нашего объекта рекомендуем в таких случаях использовать не сами чистые линии, а межлинейные гибриды первого поколения, которые генетически однородны и свободны от инбредной депрессии. Для культур, в производственных посевах которых пользуются гибридными семенами, получение материала для опытов не составляет проблемы.

В генетике широко используются различные беккроссированные линии [Коваль, 1997]. Этот удобный объект, к сожалению, еще мало применяется другими исследователями, хотя он в наибольшей степени может обеспечить выполнение правила единственного различия между изучаемыми растениями. В отличии от сравнительного изучения сортов и тем более видов, беккроссированные линии (несущие различные маркеры в тождественном генотипе) позволяют однозначно сопоставить наблюдаемые эффекты с наличием маркирующего признака. Примером корректного использования разнообразных объектов в едином исследовании является работа О.И. Гамзиковой [1994] по генетической специфике минерального питания пшениц.

К беккроссированным линиям относятся:

-   анеуплоидные линии - с отсутствием в ядре отдельных хромосом, их плеч или небольших фрагментов [Лайкова и др., 1988; Гончаров, 1992];

-   замещенные линии, которые создаются на основе анеуплоидов путем беккроссного переноса в них целых хромосом;

-   изогенные линии - с заменой в исходной чистой линии небольшого числа локусов одной хромосомы [Коваль, 1991; Крупнов и ДР., 1994];

-аллоплазматические линии- несущие ядро одной и той же чистой линии в цитоплазмах различных видов [Давыденко, 1984; Коваль, 1991].

На мягкой пшенице созданы большие серии изогенных линий по комплексу признаков (Саратов, НИИСХ Юго-Востока; Новосибирск, ИЦиГ) или тематические - по генам Ути Ppd (Одесса, СГИ), по иммунитету к бурой ржавчине и мучнистой росе (С-Петербург, ВИР), генам гибридного некроза и короткостебельности (С-Петербург, ВИР). Наша серия изогенных линий Новосибирской 67 (АНК) использовалась в качестве модельного объекта при изучении ассоциативной азотфиксации [Родынюк и др., 1991], продуктивности пшеницы на солонцеватых почвах [Коваль и др., 1991) и в связи с селекцией на засухоустойчивость [Шаманин, Лихенко, 1990; Шаманин, 1991; 1993;1994].

Большая серия аллоплазматических линий создана в ИГиЦ Беларуссии (Минск). Широко используются в мире серии аллоплазматических линий из Японии (Цуневаки) и Болгарии (Понайотов). Биологами России используются анеуплоидные серии пшеницы, созданные на сортах Чайниз спринг (Сирс), Мильтурум 553 (Цильке),

Саратовская 29 и Диамант (Майстренко).

Для создания беккроссной линии гибрид между донором маркера (анеуплоидии, типа цитоплазмы, какого то ядерного аллеля) и интересующим нас генотипом (реципиентом) вновь и вновь опыляют (беккроссируют) тем же самым реципиентом. В каждом цикле скрещивания для этого используют гибридное растение, имеющее маркирующий признак и наиболее близкое по фенотипу к реципиенту [Коваль, 1991]. С каждым повторным скрещиванием (беккроссом) вероятностная доля генетического материала донора - маркера в гибриде убывает в два раза:

Насыщение	F1	ВС1	BC4	вс8	BC10
Доля генотипа донора, %	50	25	3,12	0,2	0,05

 

Реальная же полнота замещения генотипа донора ограничена только тесным сцеплением тех или иных локусов с генетическим маркером, по которому мы ведем замещение.

Очень важно, чтобы в качестве реципиента (рекуррентного родителя) использовалась чистая линия, а не различные растения из сортовой популяции. Соблазн сохранить таким путем полиморфные достоинства рекуррентного сорта возникает от недостаточной грамотности создателя. При расщеплении материала последнего беккросса для получения гомозиготы по маркеру все равно большая часть полиморфизма будет уничтожена. Но случайное использование для насыщения различных генотипов рекуррентного сорта приведет к различиям между созданными линиями и нарушит правило единственного различия с реципиентом, который используется в качестве контроля. В равной степени, при этом нарушается и сравнимость изолиний между собой. К сожалению, изогенные линии Саратовского селекцентра и многие линии ВИРа созданы с нарушением этого правила, что необходимо учитывать при их использовании в работе.

Со времен В. Иоганзена принято считать чистые линии самоопылителей константными в поколениях. Но полная гомозиготность чистых линий видимо не всегда достижима даже теоретически. Нам остается успокаивать себя тем, что полиморфизм внутри таких линий на много порядков ниже по сравнению с обычными сортами самоопылителей.

Однако, в ряде случаев линии могут оказаться нестабильными, и в них возникают изменения. Наличие в генотипе линии сильно угнетающего физиологические процессы или полулегального аллеля может иницировать формирование комплексов генов, компенсирующих отрицательный эффект маркера. Это проявляется в возникновении в чистой линии фенотипически более мощных, наследственно стабильных генотипов. В.А. Соколовым [1990] доказано, что причиной гетерозиса у гороха при скрещивании мутанта «хлорина» с исходным генотипом является формирование комплекса генов, компенсирующих на физиологическом уровне недостаточную продукцию фотоассимилятов. В гетерозиготе первого гибридного поколения рецессивная мутация хлорина не проявляется и (в отсутствии ее депрессирующего воздействия) компенсационный комплекс дает на фенотипе эффект усиления роста (гетерозиса).

Создание изогенной линии с маркерами, дающими депрессию (хлорина, редукция листьев, анеуплоидия), может через еще неизвестные нам генетические механизмы привести к формированию таких комплексов и нарушению изогенности [Соколов, 1991]. Это указывает на возможность спонтанного изменения в геноме фенотипически депрессированных линий и на необходимость осторожно применять к ним догму В. Иоганзена о генетической однородности чистых линий. При работе с подобным материалом нужно постоянно иметь в виду динамику генетической конституции индивидов, особенно при использовании их в качестве инструмента для изучения количественных признаков [Соколов, 1991].

Нами [Коваль и др., 1993] были показаны достоверные различия между дисомными семьями, выделенными в потомстве моносомиков серии Мильтурум 553. Поскольку моносомики по всем критическим хромосомам создаются на основе одной и той же чистой линии рекуррентного родителя, постулат о полном сходстве их генотипов принимается как нечто само собой разумеющееся. Из него же молча предполагается, что все количественные различия моносомных семей или созданных на их основе замещенных линий определяются моносомным состоянием (замещением) критической хромосомы. Но моносомия является частным случаем тяжелого генетического нарушения (болезни). В ряду поколений моносомика возникают компенсационные комплексы генов, ослабляющие эффект генетического дисбаланса. При репродукции моносомиков исследователь старается оставлять на семена наиболее продуктивные растения и тем самым способствует сохранению наследственных изменений. Установленный нами факт нетождественности потомков моносомных линий ставит под сомнение саму возможность изучения генетики количественных признаков с использованием моносомного метода. Все сказанное выше о чистых линиях относится к материалу, маркированному только по одному признаку (гену). В последнее время в генетике и молекулярной биологии часто используются множественные маркеры, т.е. линии, маркированные по многим локусам. Они незаменимы при картировании генов, но применение их в других областях исследования не желательно. Межлокусное взаимодействие маркирующих аллелей слишком часто дает нежелательные плейотропные эффекты, делающие такую линию не сравнимой ни с каким стандартом.

Вес сказанное выше должно еще раз напомнить, что любой объект имеет ограниченную область применения, за пределами которой результаты опыта становятся артефактами, и что к выбору модели исследователь должен относиться не менее внимательно, чем к подбору прописей анализов.

Несмотря на предупредительные меры, засорение и изменение образцов все же происходит. В доступной авторам литературе нигде не оговариваются классы чистоты образцов, подобно установленным в химии характеристикам реактивов. Чистоту образцов по засорению и направление их использования можно стандартизировать по аналогии с индексацией в химии [Коваль, 1993]:

1. «Эталон». Образец, сохраняемый без пересева в том виде, как он был получен исследователем со стороны (от создателя образца, из другого учреждения или банка, собран в дикой природе или создан самим исследователем). Сохраняется даже после потери всхожести для возможных анализов маркеров. Все присутствующие в нем генотипы не считаются засорением, а относятся к полиморфизму образца. Линейные образцы фактически имеют нулевое засорение.

2. «Для генетического анализа». Получен пересевом «эталона» и в дальнейшем репродуцируется только при изоляции соцветий (индивидуальной или групповой в зависимости от биологии опыления). Используется в генетических исследованиях и при анализе малого количества биомассы в биохимии и клеточной биологии. Засорение: возможны мутанты с частотой 1/100000.

3. «Для фи:1иоло1ии». Получен в первой репродукции без изоляторов образца предыдущего класса, на семена, как правило, не оставляется, а возобновляется из семян «для генетического анализа». Используются в лабораторных, вегетационных и микроделяночных (рядковых) полевых опытах при количестве сырой биомассы, потребной для одного анализа от 10 до 50 г. Засорение: мутанты и примеси до 1/500.

4. «Для полевых опытов». Получен 1 -2 кратным пересевом образца 3-го класса, дальнейшее репродуцирование нежелательно (кроме случаев специальных популяционных исследований). Допустимо возобновление непосредственно из крупной партии образца 1-го класса (эталона). Используются в крупноделяночных полевых опытах по сортоиспытанию, агрохимии, земледелию и т.д. Допустимое механическое и гибридогенное засорение: до 1 %.

Источником экспериментальных объектов могут служить элитные образцы сортов, получаемые из учреждений - оригинаторов, специально создаваемые селекционные доноры [Мережко, 1994], материал национальных хранилищ ВИРа и различных генетических коллекций (банков).

Сейчас созданы генетические банки генофонда плодовых культур [Ерсмин, 1983] и лесных пород [Петров, Шутяев, 1983], кукурузы [Мику, 1983; Шмараев, Подольская, 1994], люцерны [Дззюбенко, Дзюбенко, 1994], пшеницы [Митрофанова, 1993; Гончаров, 1993], сахарной свеклы [Малецкий и др., 1970], ржавчинных грибов [Запряхина, Нексла 1990], эукариотических водорослей [Квитко и др. 1982], арабидопсиса [Шевченко, Гриних, 1983] и многих других растений. Это позволяет исследователям включать в работу почти неограниченное разнообразие чистых линий, мутантов, изогенных, аллоплазматических, замещенных линий, маркированных по различным признакам.

В заключении этой главы сформулируем несколько основных правил:

1.  Никогда не пользоваться случайно подвернувшимися под руку растениями или семенами.

2.  Постоянно поддерживайте коллекцию наиболее интересных образцов. Это экономит время, необходимое для получения материала из ресурсных банков.

3.  Прежде чем приступить к самостоятельному созданию объектов для эксперимента узнайте, не имеется ли подобный материал в ресурсных банках.

4.  Если это возможно, получайте семена коммерческих сортов и селекционные образцы непосредственно от их создателей, а не от пользователей-посредников.

5.  Не включайте в опыты только что полученные образцы. Даже в наиболее солидных учреждениях возможна путаница с названием образцов или их засорение. Все вновь полученные образцы следует пересевать для проверки на чистоту и соответствие их фенотипа сопроводительным документам.

6.  Если работа предполагает анализ отдельных растений, следует использовать только генетически однородный материал (чистые линии, беккроссированные линии или межлинейные гибриды первого поколения).

7.  Будьте осторожны в уничтожении, казалось бы, ненужных образцов (даже если они потеряли всхожесть). Возможно, через несколько лег вам потребуется изучить некоторые их характеристики (например - электрофореграммы запасных белков). Следует помнить, что смешать и выбросить семена никогда не поздно!