Метод основан на использовании антител, меченых ферментами. Впервые метод твердофазного ИФА (ELISA – enzyme-linked-immunosorbent) для диагностики вирусов растений был разработан в 1976. В качестве твердофазной основы используются специальные полистирольные 96-луночные платы.

Оптически прозрачный полистирол обладает способностью адсорбировать антигены и антитела на своей поверхности. Эта способность полистирола, а также конструкция микроплат позволяют проводить весь цикл анализа в каждой из лунок пробы. Существует несколько модификаций метода ИФА.

1. Прямой метод. В лунки плат вносят тестируемый антиген, инкубируют в течение ночи при 4°, удаляют избыток антигена промыванием и добавляют конъюгат (вирусоспецифическое антитело, меченое ферментом). Удаляют избыток конъюгата и добавляют субстрат (хромоген).

Если используется в качестве фермента щелочная фосфатаза, то субстратом служит N-нитрофинилфосфат. В случае пероксидазы – 5-аминосалициловая кислота или ортофенилендиамин.

2. Непрямой метод. Как и в первом случае, тестируемый антиген адсорбируется на поверхности лунок, после отмывки в лунки вносят вирусоспецифические кроличьи антитела и после отмывки – конъюгат (антикроличьи тела меченые ферментом). Далее, как обычно, смесь инкубируют с субстратом.

3. Наиболее широко используется сэндвич-метод ИФА. При этом на поверхности лунок фиксируются специфические антитела, обычно в течение ночи. После добавления тестируемого образца, антитела связывают содержащийся в пробах вирус, который затем выявляется с помощью специфических антител, меченых ферментом, после добавления хромогенного субстрата.

Разработка методов иммуноферментной диагностики и внедрение их в практику требует решения целого ряда проблем, связанных с выделением высокоочищенных препаратов вирусов (антигенов), получением больших количеств специфических антител, отработкой эффективных методов мечения антител ферментами и оптимизацией условий проведения анализа.

Вирусные препараты, которые используются при иммунизации животных для получения антител, применяемых в иммунодиагностике, должны удовлетворять целому ряду требований. Основные из них следующие: максимальное сохранение антигенных свойств, отсутствие загрязнения другими вирусами и компонентами растений-накопителей.

Наличие высококачественных препаратов вирусов обеспечивает получение специфических антител (в сыворотке иммунизированных животных), специфических к тому или иному антигену.

Использование высокоочищенных препаратов вирусов и специально разработанных схем иммунизации животных позволяет получать сыворотки с высоким содержанием антител, пригодных для использования в ИФА.

Всероссийским институтом картофельного хозяйства совместно с кафедрой вирусологии МГУ и Институтом молекулярной биологии создана технология производства иммуноспецифических препаратов для диагностики вирусных и бактериальных инфекций картофеля методом ИФА, включающим четыре этапа.

На первом этапе накапливают биологически чистый материал с тем или иным вирусом картофеля. Чистые моноштаммы выделяют из природных популяций или из смеси вирусов с помощью переносчиков вирусов – тлей или при культивировании на иммунных к прочим вирусам растениях. Существенную трудность на этом этапе представляет сохранение штаммов вирусов в стерильных изолированных условиях. С этой целью во ВНИИКХ разработана специальная методика поддержания штаммов вирусов in vitro на восприимчивых растениях. В дальнейшем эти штаммы используют для получения инокулюма и заражения растений-накопителей, выращиваемых в изоляторах. Накопление вирусов контролируется методом ИФА.

На втором этапе выделяют вирусы в период наибольшей их концентрации по методике, основанной на использовании многоэтапных схем очистки, включающих обработку растительных тканей ферментами или детергентами, дифференциальное центрифугирование, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы и солей тяжелых металлов.

На третьем этапе препараты вирусов немедленно используют для иммунизации или консервируют глицерином (1:1) и хранят при температуре 10-15°. Перед иммунизацией кроликов глицерин удаляют с помощью диализа. Схема иммунизации включает различные сочетания внутримышечных, подкожных и внутривенных инъекций с использованием неполного адъюванта Фрейнла.

На четвертом этапе выделяют иммуноглобулинную фракцию с помощью высаливания сульфатом аммония, затем ее конъюгируют периодатным методом с высокоочищенной пероксидазой из хрена.

Для массовых анализов непосредственно в семеноводческих комплексах разработан набор реагентов для иммуноферментных определений. В него входят, помимо основных иммуноспецифических реагентов, все неспецифические ингредиенты. Иммуноферментные диагностические наборы прошли проверку в опытных хозяйствах ВНИИКХ, а также в ведущих научно-исследовательских институтах.

Чувствительность определения вирусов методом ИФА с помощью диагностических наборов в 100-1000 раз выше чувствительности метода капельной агглютинации и составляет около 10 нг/мл сока. Высокая чувствительность и специфичность метода открывает новые возможности для его применения в селекционно-семеноводческой работе по картофелю.

ИФА с высокой степенью точности позволяет определять наличие вирусов в проросших клубнях картофеля. Результаты тестирования с помощью ИФА клубней картофеля и растений из этих клубней показали совпадение по положительным результатам в 98,6 % случаев. Это позволяет все работы по оценке клонового или селекционного материала проводить в зимний период.

Результаты ИФА оцениваются как визуально, по интенсивности окраски в лунках плат, так и фотометрически, с помощью специального прибора – в единицах оптической плотности (при этом можно определять концентрацию вирусов в растениях).

Чтобы повысить производительность работы по оценке семенного материала, во ВНИИКХ путем иммунизации кроликов смесью вирусов X+S+М+F получена поливалентная сыворотка, позволяющая снизить затраты на массовые анализы в 6 раз. При этом чувствительность определения вирусов не снижается по сравнению с моновалентными сыворотками, а величины светопоглощения при положительных реакциях возрастают примерно в 2 раза.

Чувствительность определения возбудителей черной ножки с помощью ИФА повысилась в 10000 раз, а кольцевой гнили – в 1000 раз в сравнении с методом капельной диагностики.

Биотехнологический центр ВНИИКХ освоил промышленный выпуск диагностических наборов для ИФА на вирусы X, S, M, А, F, Y, L, вирус табачной мозаики, андийский латентный вирус, полиспецифический на вирусы X+S+М+F, а также на бактерии – возбудители черной ножки и кольцевой гнили картофеля.

В состав набора, рассчитанного на 1000 анализов, входят:

- покровный буфер (лиофилизат карбонатного буфера, рН 9,6);

- промывочный буфер (порошкообразная смесь солей, рН 7,4);

- бычий сывороточный альбумин (сухой препарат);

- субстратный буфер (пятикратный жидкий концентрат фосфатно-ацетатного буфера, законсервированного 0,01 %-ным мертиолятом, рН 5,0);

- детергент (жидкий препарат);

-субстрат (ортофенилендиамин, кристаллический порошок);

- перекись водорода (коммерческий гидропирит в таблетках);

- антитела (кроличьи специфические иммуноглобулины, лиофилизат);

- конъюгат (кроличьи или мышиные иммуноглобулины, меченые перексидазой хрена, жидкий концентрат в 50 %-ном глицерине);

- положительный контроль (очищенный вирус, жидкий концентрат в 50 %-ном глицерине);

- полистирольные 96-луночные планшеты для иммунологических реакций – 10 шт.;

- инструкция по применению.

Биотехнологический центр по договорам высылает наборы всем заинтересованным научно-исследовательским организациям и семеноводческим хозяйствам.