АгроСборник.Ру

Приготовление суспензий, содержащих объект исследований, осуществляется следующим образом. Для получения суспензий из колоний, выросших на твердой среде, делают их смыв стерильной дистиллированной водой. Иногда применяют встряхивания (для рода Fusarium). Чистую культуру гриба нарезают на квадраты примерно 1х1 см, помещают в колбу со стерильной водой и ставят на качалку (30 мин). После окончания встряхивания проводят подсчет колоний.

При искусственном заражении используют 1-2-суточную культуру бактерий, 10-14-дневную культуру гриба Ph. infestans, 10-дневную культуру грибов p.Rhizoctonia, p.Fusarium, p.Alternaria, 12-15-дневную культуру гриба Phoma exiqua.

Плотность суспензии зависит от избранных методов инокуляции. Для заражения обычно используют бактериальную суспензию с густотой взвеси от 500 млн. до 1 млрд. клеток в 1 мл. Оптимальная концентрация грибной суспензии для инокуляции составляет у грибов р.Fusarium, p.Phoma, p.Alternaria, p.Rhizoctonia – 30-50 шт., Ph. infestans – 18-20 шт. в поле зрения микроскопа при малом увеличении (10х10).

Дозировку грибной суспензии определяют, просматривая не менее 10 капель под микроскопом при увеличении 100-200 и подсчитывая число конидий в поле зрения. Затем рассчитывают среднее арифметическое число. Желательно, чтобы споры распределялись в суспензии равномерно и в каждой капле их количество было примерно одинаковым (различие от средней величины не должно быть более ±10 %). Если это условие не соблюдается, суспензию дополнительно перемешивают. При искусственном заражении грибом Ph. infestans емкость с суспензией гриба необходимо помещать на 2-3 часа в холодильник для выхода зооспор.

Число бактериальных клеток в суспензии можно определить двумя путями:

- турбидиметрическими измерениями мутности стандартных и изучаемых бактериальных суспензий (шкала Мак-Фарланда, фотоэлектрические измерения колориметром, спектрофотометром и денситометром). Чаще используют шкалу Мак-Фарланда. Просматривая в проходящем свете поочередно пробирку с исследуемой суспензией бактериальных клеток и стандартную пробирку мутности, определяют плотность бактериальной суспензии (Методы фитопатология, М., 1974, с. 111);

 

Номер пробирки

Стандартные мутности растворы, мл

Число бактериальных клеток в 1 мл суспензии, млн. шт.

1 %-ный BaCl

1 %-ный H2SO4

1

0,01

9,99

30

2

0,05

9,95

150

3

0,10

9,90

300

4

0,15

9,85

450

5

0,20

9,80

600

6

0,30

9,70

900

7

0,40

9,60

1200

- подсчетом колоний. Из бактериальной суспензии делают несколько разведений. Образцы суспензии из пробирок определенного ряда разведений высевают в чашки Петри на агаровую среду. Подсчет количества развившихся колоний показывает число бактериальных клеток в исходной суспензии.

Измерение линейного роста колоний грибов. Для определения линейного роста колоний, растущих на плотной среде, в чашках Петри с одинаковым слоем среды измеряют их диаметр (от места посева до конца зоны роста мицелия), через определенные промежутки времени. В некоторых случаях измерение производят в специальных пробирках с застывшим горизонтальным слоем плотной среды равномерной толщины. Гриб высевают в центр поверхности плотной питательной среды. Диаметр колоний измеряют в двух взаимно перпендикулярных направлениях, через определенные промежутки времени. (При работе с бактериями этот показатель не учитывается).

Определение интенсивности спорообразования. Интенсивность спорообразования при росте гриба на плотной среде определяют в счетной камере или в нескольких полях зрения микроскопа по количеству спор в определенном объеме взвеси.

Для этого блок агаровой культуры определенной площади помещают в определенный объем физиологического раствора или жидкой среды и в течение нескольких минут встряхивают на качалке для освобождения спор и перехода их во взвесь. Блоки агаровой культуры можно брать лабораторным сверлом. При росте гриба в чашках Петри, например, блоки вырезают вдоль линии окружности. При поверхностном или погруженном культивировании в жидкой питательной среде интенсивность спорообразования определяют по количеству конидий в определенном объеме культуральной жидкости. Пробу культуры, помещенную в жидкую среду, встряхивают на аппарате в течение 15-30 мин и центрифугируют. Время осаждения спор зависит от вида гриба и определяется экспериментально. Из определенной навески осадка спор готовят взвесь и в счетной камере Горяева (Бюркера) подсчитывают число спор в единице объема. (Методы фитопатологии, М., 1976, с. 186).

Проверка жизнеспособности инокулюма. Жизнеспособность конидий, спор, взятых для заражения, определяют проращиванием их в лабораторных условиях. Проращивают конидии в каплях воды на предметных стеклах, помещенных в чашки Петри, или во влажных камерах, приготовленных из колец Ван Тигена. На дно чашек Петри наливают воду, кладут спички или короткие стеклянные палочки и на них размещают одно-два предметных стекла. На каждое предметноe стекло наносят 2-3 капли воды, в которые вносят конидии чистой культуры или приготовленную конидиальную суспензию. Чашки Петри с каплями суспензии на предметных стеклах накрывают крышками и ставят в термостат при температуре, необходимой для проращивания определенного гриба. При использовании влажных камер простерилизованные кольца Ван Тигена прикрепляют к предметным стеклам вазелином, которым смазывают также и верхнюю часть: на дно кольца помещают каплю стерильной воды. Затем на нижнюю сторону покровного стекла наносят каплю суспензии, в которую кладут кусочек ткани, вырезанной из промытого в стерильной воде восприимчивого органа питающего гриб растения. После этого стекло прижимают к кольцу. При использовании первого метода учет конидий ведут под малым увеличением микроскопа, а при использовании второго метода – под большим.

Наблюдения за прорастанием конидий проводят через 6-8 ч. Жизнеспособность конидий проверяют путем подсчета количества проросших конидий не менее чем в десяти каплях. Проросшими считают те конидии, у которых длина ростковых трубок (гиф) превышает их длину. Для заражения используют суспензию, в которой жизнеспособность конидий не менее 80 %.

Добавить комментарий

Вы можете оставить свой комментарий авторизовавшись при помощи любой из представленный социальных сетей:

       


Защитный код
Обновить

Поделиться!

Понравилась статья? Расскажите о ней знакомым или оставьте комментарий!

Написать в Facebook Поделиться ВКонтакте В Google Buzz Записать себе в LiveJournal Показать В Моем Мире В дневник на LI.RU Поделиться ссылкой в Моем Круге

Авторизация

Сотрудничество|Обмен ссылками|Связаться с нами

АгроСборник.Ру © 2011-2017. Все Права Защищены.


Яндекс.Метрика