С каждой делянки отбирают один образец почвы, который состоит из 10 разовых проб, взятых с различных мест, расположенных по делянке в шахматном порядке или по диагонали. Образец берется с вертикального разреза почвы, сделанного на всю глубину пахотного слоя путем соскоба. Верхний слой почвы (1,5-2 см) снимают стерильным ножом или совком. Инструмент для взятия соскоба обеззараживают спиртом перед взятием каждого нового образца. Для грубого анализа ножи (совки, лопаты) допустимо очищать их многократным тыканьем в почву следующих исследуемых делянок. Образцы помещают в стерильную тару (банки, колбы, бюксы, пакеты) с указанием номера делянки. Почву следует анализировать в день отбора.

Приготовление почвенной суспензии. Исследуемую почву тщательно перемешивают на стерильном стекле, удаляя растительные остатки и механические примеси. Соблюдая стерильность, отвешивают по 10 г почвы каждого образца. Одновременно готовят бюксы с почвой с тех же образцов для определения влажности почвы. Навеску почвы увлажняют стерильной водой (2-3 мл из общего количества 90 мл) в ступке, тщательно растирают и переносят с помощью оставшейся воды в стерильную колбу с пробиркой. Колбы встряхивают на качалке в течение 30 мин, дают отстояться 1-2 мин и переносят 1 мл суспензии в первую пробирку с 9 мл стерильной воды, получая разведение 1:100. После перемешивания новой, стерильной пипеткой переносят 1 мл суспензии во вторую пробирку и т.д., получая ряд последовательных разведений. Для посева используют то разведение, которое в зависимости от сезона, температуры и влажности дает рост 50-150 колоний на питательной среде в чашках Петри.

Учет микроорганизмов на твердых питательных средах. Для выделения и количественного учета микроорганизмов почвенную суспензии высевают на твердую питательную среду в чашки Петри. Для этого микропипеткой на 0,1 мл наносят суспензию по 0,05 мл в центр чашки и равномерно растирают ее стерильным шпателем по поверхности среды. Посев рекомендуется проводить из двух соседних разведений, минимум в 3-5 повторностях. Для дерново-подзолистой почвы наиболее оптимальными разведениями для посева являются: 2-е, 3-е – весной и осенью, 4-е – летом (для грибов и стрептомицетов) и 5-е (для бактерий). Через 3-5 дней проводят подсчет колоний бактерий, через 5-7 дней – грибов и дрожжей и через 7-15 дней – актиномицетов. Количество микроорганизмов на 1 г абсолютно сухой почвы А подсчитывают по формуле:

где А_ср – среднее число колоний микроорганизмов в чашках Петри;

n – соответствующее разведение;

б – количество капель в 1 мл суспензии в пипетке (1 мл:0,05 мл = 20);

Вл – влажность почвы, %.

Учет общего количества почвенных микроорганизмов осуществляют на среде крахмало-аммиачный агар (ККА), аэробных аммонификаторов – на мясо-пептонном агаре (МПА), нитрификаторов – на голодном агаре с комплексной аммонийномагниевой солью фосфорной кислоты, целлюлозорасщепляющих микроорганизмов – на среде Гетчинсона с фильтровальной бумагой, грибов – на среде Чапека-Докса, актиномицетов – на среде СР-1 (по Красильникову).

Метод предельных разведений на жидких питательных средах используют для количественного учета микроорганизмов. В пробирки с жидкой питательней средой высевают по 1 мл почвенной суспензии, по 3-5 пробирок каждого разведения. Для учета микроорганизмов с высокой численностью рекомендуется высевать суспензию высоких разведений, для малораспространенных – из первых разведений. Засеянные пробирки помещают в термостат до появления признаков роста микроорганизмов. Для определения числа клеток в пробирках составляют числовую характеристику (ЧХ). Она состоит из цифр. Первая цифра соответствует числу пробирок последнего разведения, когда рост микроорганизмов отмечается в пробирках всех повторностей. Следующие две цифры – число пробирок с ростом двух последующих разведений. По полученной ЧХ находят вероятное число микроорганизмов в 1 мл разведения, принятого за первую цифру ЧХ, по таблице Мак-Креди. Это число умножают на соответствующее разведение и получают количество микроорганизмов в 1 г почвы. Затем учитывается процент влажности почвы. Метод предельных разведений используют для учета анаэробных амонификаторов (МБП) и денитрификаторов на среде Гильтая.

Метод почвенных комочков применяется для исследования малого количества микроорганизмов. На твердую питательную среду раскладывают 0,1 г почвы с помощью микробиологической петли. Почвы предварительно увлажняют до пастообразного состояния. Подсчитывают процент комочков, обросших микроорганизмами данной группы. Этим методом определяют количество бактерий рода Azotobacter в почве (среда Эшби).

Диагностические питательные среды для выращивания почвенных микроорганизмов. Крахмало-аммиачная среда (г/л): растворимый крахмал – 10, (NH₄)₂SO₄ – 1; MgSO₄ – 1; NaCl – 1; СаCO₃ – 3, агар – 20, дистиллированная вода – 1 л.

Голодный агар с комплексной аммонийномагниевой солью фосфорной кислоты. Для приготовления среды агар тщательно промывают проточной водой или в 10 стаканах дистиллированной воды до бесцветного состояния и готовят пластинки в чашках Петри. Комплексную соль, предварительно прокипяченную 15 мин в дистиллированной воде, в количестве 0,2-0,3 г растирают в ступке 1 мл суспензии второго разведения.

Приготовление комплексной соли. Готовят два раствора: 1,25 г хлористого аммония и 20 г сернокислого магния растворяют в 200 мл дистиллированной воды; 2,10 г Na₂HPO₄ или NaH₂PO₄ растворяют в 100 мл воды. Оба раствора сливают вместе и оставляют на 30-40 мин. Добавляют 10 мл насыщенного раствора хлористого аммония и по каплям 2,5 %-ный аммиак до появления в растворе четкого запаха аммиака. Затем добавляют избыток аммиака и оставляют на 10-15 мин для реакций, в течение которых выпадает соль. Соль необходимо отфильтровать, промыть дистиллированной водой до исчезновения запаха аммиака и высушить.

Среда Гильтая (г/л): C₆H₅O₇*Na₂*2H₂О – 2, KNO₃ – 1, K₂HPO₄ – 1, KH₂P0₄ – 1, MgSO₄ – 0,55, CaCl₂ – 0,2, FeCl₃ – следы, 1 %-ный спиртовой раствор бромтимолблау до зеленой окраски.

Среда Гетчисона (г/л): K₂HPO₄ – 1, CaCl₂ – 0,1, MgSO₄*7H₂О – 0,3, NaCl – 0,1; FeCl₃ – 0,01, NaNO₃ – 2,5, целлюлозный порошок – 5, агар – 20, дистиллированная вода – 1 л.

На поверхность застывшей среды в чашку Петри кладут диск стерильной фильтровальной бумаги.

Среда Эшби (г/л): моннит – 20, K₂HPO₄ – 0,2, MgSO₄*7H₂О – 0,2, NaCl – 0,2; K₂ SO₄ – 0,1, CaCl₃ – 5,0, агар – 20.

Среда СР-1 по Красильникову (г/л): крахмал растворимый– 20, K₂HPO₄ – 0,5, MgSO₄ – 0,5, KNO₃ – 1, NaCl – 0,5; Fe SO₄ – 0,01, агар – 20, рН среды – 7,2-7,4.

Среда Чапека-Докса (г/л): сахароза – 30, NaNO₃ – 2, K₂HPO₄ – 1, MgSO₄*7H₂О – 0,5, KCl – 0,5; Fe SO₄*7H₂О – 0,01, агар – 20, стрептомицин – 20 мкг, рН среды – 5,0-5,5. Стерилизация 30 мин при 1 атм.

Содержание и хранение культур микроорганизмов. Коллекция культур микроорганизмов поддерживается методом периодического пересева на свежие питательные среды. Когда колонии достигнут достаточных размеров, пробирки с культурами помещают в холодильник. Пересев для культур бактерий осуществляют 3-4, а актиномицетов – 2 раза в год.