АгроСборник.Ру

Гриб, выделенный из листьев или клубней и пересеянный затем на ломтики картофеля указанным выше способом, может при периодических пересевах сохраняться длительные сроки. Пересев необходим примерно раз в 6 дней. При хранении чашек при 6-8°С его можно делать раз в 8-10 дней. При закладке на хранение следует убедиться в приживании инфекции, нанесенной на ломтики при пересеве. Чашки сразу же после посева нужно выдерживать 2-3 дня при температуре 18-20°С.

Для поддержания культуры, при длительном ее хранении на ломтиках, в зависимости от задач, берут клубни или просто восприимчивого сорта (без R-генов) или сорта, соответствующие генотипу рас.

Культуру гриба можно хранить и в целых клубнях. Для этого отбирают здоровые клубни восприимчивых сортов, тщательно моют и обсушивают их. Инокулирование клубней проводят следующим способом. Скальпелем, пронесенным через пламя спиртовки, делают небольшой на глубину 0,5 см надрез и в место надреза иглой вносят инокулюм. Надрезанную часть плотно прижимают к клубню, затем клубни выдерживают 3-4 суток при температуре 18-20°С. После этого их складывают в ящики и помещают в условия хранения при температуре 2-5°С.

Инокулюм в клубень можно вносить и в виде взвеси по 1 капле в надрез. Взвесь можно наносить и на поверхность клубня, повредив его поверхность. При таком способе инфицирования клубней инокулюм можно дозировать, используя взвесь любой концентрации и, тем самым, выявляя вирулентность патогена.

Инфицирование клубней проводят свежеприготовленной конидиальной взвесью гриба. Инокулюм берется от культуры 6-10-дневдого возраста с хорошо развитым мицелием и выполненными конидиями. Конидиальная взвесь не должна быть очень густой (5-8 конидий). При пониженной температуре развитие гриба идет очень медленно. Только через 2-3 месяца он успевает распространиться на большую часть клубня. Для последующего выделения фитофторы из клубня их разрезают пополам и ставят во влажную камеру для образования конидиального налета. После этого инокулюм может быть использован для проведения различных работ.

Поддержание культуры может осуществляться и в пробирках на искусственных средах при температуре +8°С. При таких температурах пересев гриба может быть раз в 1-2 месяца.

В зависимости от целей и задач используют различные питательные среды. Для получения быстрого роста и образования обильного спороношения рекомендуется овсяно-гороховая среда – для получения больших количеств инфекционного начала при проведении масштабных опытов с заражением растений. В условиях повышенных температур (20-25°С) на этой среде при частых пересевах и длительном хранении происходит ослабление вирулентности фитофторы, вплоть до полной сапрофитизации культуры. Более длительное сохранение обеспечивается при развитии гриба на агаризованных синтетических средах в пробирках. Хорошее сохранение фитофторы обеспечивается на среде Хеннигера, Хелла. Для выявления степени паразитической активности (расы, штаммы) используют среды, более бедные по составу. Среды могут быть использованы и жидкие, (для различных биохимических исследований, для обеспечения большого сбора мицелиальной массы гриба). Выращивание на жидких средах проводят в колбах Эрленмейера емкостью 200 см3. Объем жидкости – 100 см3. Для быстрого развития гриба рекомендуется после пересева в первые 2-3 дня ежедневно несколько раз встряхивать колбы в течение 2-5 мин. Можно в этих целях использовать Шюттель-аппарат. Это обеспечивает рассеивание инокулюма, создание большого количества очагов роста гриба, что приводит в последующем к быстрому накоплению мицелиальной массы. Для длительного хранения фитофторы на твердых средах (в пробирках) рекомендуется сохранение культуры под слоем масла - парафинового или растительного (подсолнечного). Масло в этих целях должно быть предварительно простерилизовано при 1 атм. 20 мин. Перед стерилизацией растительное масло необходимо профильтровать (от взвешенных частиц) через слой ваты. Масло наливается в пробирку с таким расчетом, чтобы оно покрывало не только весь скос агара, но и было примерно на 2 см выше. Следует наливать масло в пробирки, соблюдая стерильность, как обычно при пересевах.

Состав сред.

1. Среда Хелла, жидкая для выращивания фитофторы. На 1 л дистиллированной воды – КН2РО4 – 0,5 г, MgS04 * 7 Н2О – 0,25 г, FeS04 – 0,01 г, глюкозы 25 г, аспарагина – 0,5 г, витамина В1 – 0,002 мг, В2 – 0,002 мг. Стерилизовать 30 мин. текучим паром или 20 минут при 1 атм.

2. Среда Хеннигера.

Состав среды: 100 мл дистиллированной воды, КН2РО4 – 40 мг, NaNO3 – 40 мг, СаCl2 – 10 мг, МgСО3 – 10 мг, (NH4)2S04 – 10 мг, FeSO4 * 7 Н2О – 2 мг, янтарная кислота – 20 мг или DL-аспарагин – 40 мг, глутамин – 40 мг, DL- лейцин – 10 мг, аргинин – 20 мг, гликокол – 20 мг, цистеин гидрохлорида – 10-20 мг, аневрин (В1) – 0,001 мг (на 1 л), глюкоза 10 г (на 1 л), сахароза 500 г, рН – 5,0-5,2.

Более агрессивные расы проявляют меньшую чувствительность к недостатку кальция, наличие которого очень важно для развития фитофторы. Все расы могут использовать азот как органический, так и неорганический.

Интенсивное накопление сухого вещества в условиях обеденной среды (например, среда 2) также может быть показателем повышенной паразитической активности изолята. В еще большей степени это выявляется при использовании среды 1.

3. Овсяно-гороховая среда. На 1 л дистиллированной воды берут 20 г агар-агара и оставляет для набухания на 1-2 ч. После этого добавляют 50 г овсяной муки и ставят на водяную баню до полного растворения агар-агара (2-3 ч.). Для приготовления муки можно использовать овсяные хлопья – геркулес, предварительно размельченные на мельнице типа "Пируэт". Затем добавляют 10 г сахарозы или глюкозы и 100 мл вытяжки горохового сока, который приготовляют из 250 г свежего или свежезамороженного зеленого горошка. Для этой цели горошек пропускают через мясорубку, добавляют 100 мл дистиллированной воды, ставят на 1 ч. в качалку, кашицу отжимают через марлю. Полученный сок добавляют в приготовленную среду и разливают по пробиркам. Пробирки стерилизуют при 1 атм. 20 мин.

При длительном хранении фитофторы в культуре ее паразитическая активность может быть ослаблена, в особенности при хранении на искусственных питательных средах, богатых органикой. Повышение температуры (20-25°С) усиливает эффект снижения вирулентности. Для повышения ее прибегают к пассированию изолята на ломтиках картофеля восприимчивых сортов (1-2 генерации). При проведении пассажей инокулюм берут с наиболее чистых участков поражения клубня.

Снижение паразитической активности у различных изолятов одной и той же расы неодинаково. Могут быть выделены такие изоляты расы, которые очень стойко сохраняют, в отличие от других, свою вирулентность.

Получение культуры фитофторы из хламидоспор гриба. Изолят расы, штамма из хламидоспор гриба имеет повышенную жизнедеятельность. Это проявляется в ускорении прорастания конидий, образовавшихся при развитии хламидоспор, в массовом 100 %-ном их прорастании. Хламидоспора прорастает в росток с образованием конидий.

Для образования хламидоспор у расы, штамма необходимо длительно выдерживать культуру без пересева при 8-10° на искусственной питательной среде (лучше овсяно-гороховой). В зависимости от расы время их появления в культуре различно: от 3-4 до 9 месяцев и более. Первое появление обнаруживается в местах подсыхания, в периферийной части агарового скоса среды в пробирке.

Методика выделения моноспоровых культур с помощью микроманипулятора. Для проведения работ с расами возбудителя фитофторы, изучения его изменчивости необходимо иметь моноспоровые или монозооспоровые культуры. Использование микроманипулятора ММ-1 позволяет очень быстро получать моноспоровые или монозооспоровые изоляты гриба. Для этого на предметное стекло пипеткой наносят каплю конидиальной взвеси гриба в стерильной воде. Количество конидий в капле должно быть не более 10, так как при густой взвеси выделение будет затруднено. Предметное стекло со взвесью (или несколько стекол) помещают в чашку Петри при температуре 9-12°С на 20-30 мин. для выхода зооспор. Последующую работу по выделению монозооспоровых изолятов проводят под микроокопом (МБИ-3). Для выделения изолятов необходимо иметь пипетки с тонко оттянутым на спиртовке капиллярным концом. На противоположный конец пипетки надевают резиновую трубочку, через которую вдувается и выдувается воздух. Пипетку в таком виде закрепляют в "руках" микроманипулятора с правой стороны. Острый оттянутый конец трубки (капилляр) с помощью передвигающегося устройства микроманипулятора помещают над каплей суспензии, приготовленной заранее. Макро- и микровинтами манипулятора плавно опускают капилляр в каплю, следя в микроскоп за его погружением (х 120). При погружении капилляра легким выдуванием воздуха через трубку не дают жидкости заполнить капилляр. Затем с помощью передвигающегося устройства подводят капилляр к конидии (зооспоре).

При легком всасывании жидкости в капилляр поступает и конидия (зооспора). Капилляр при этом должен быть всегда в поле зрения микроскопа.

Сразу же после этого капилляр поднимают при помощи винта в исходное положение и просматривают под микроскопом – действительно ли одна зооспора или конидия вошла в капилляр.

Конидия (зооспора) из капилляра должна быть перенесена на субстрат для изолированного выращивания. В качестве такого субстрата для фитофторы рекомендуется использовать клубни восприимчивого сорта картофеля.

Свеженарезанные ломтики клубней помещают в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой. Конидию (зооспору), находящуюся в капилляре, путем выдувания переносят на ломтик. Чашки Петри с выделенными изолятами помещают при температуре 18-20°С.

На 7-8-й день ухе хорошо виден развившийся мицелий. Вначале образуется очень незначительный конидиальный налет. На 9-10-й день мицелий охватывает до 30 % поверхности ломтика. Затем изолят выделяют в чистую культуру – в пробирку с искусственной питательной средой. Выделение изолятов при использовании этого метода идет сразу в капле стерильной воды, без предварительного посева на искусственную среду. Кроме того, при таком методе выделения нет необходимости создавать стерильные условия на месте работы, так как сразу же при посеве изолированной конидии (зооспоры) на клубень создаем условия для развития чистой культуры гриба. Работу при этом можно проводить без использования специальных камер, специальных насадок, к микроскопу, без предварительной стерилизации окружающего пространства.

Выделение изолятов без предварительного посева на искусственную среду практически исключает дальнейшее загрязнение их сапрофитными организмами, что позволяет сохранить до 90 % выделенных изолятов, упрощает и ускоряет их выделение. При достаточном навыке работы с микроманипулятором за 6-7 ч. можно выделить 150-200 изолятов. Применение метода возможно и для выделения моноспоровых изолятов других видов грибов.

Добавить комментарий

Вы можете оставить свой комментарий авторизовавшись при помощи любой из представленный социальных сетей:

       


Защитный код
Обновить

Поделиться!

Понравилась статья? Расскажите о ней знакомым или оставьте комментарий!

Написать в Facebook Поделиться ВКонтакте В Google Buzz Записать себе в LiveJournal Показать В Моем Мире В дневник на LI.RU Поделиться ссылкой в Моем Круге

Авторизация