АгроСборник.Ру

Для оценки резистентности изолятов P. infestans к фунгицидам используют разные методы. Однако наиболее пригодны методы, которые связаны с заражением живых растений или их частей, обработанных фунгицидами в разных концентрациях. Оценка резистентности, проведенная а опытах in vitro на питательных средах, не всегда подтверждается в опытах in vivo.

В литературных источниках предлагаются следующие методы оценки резистентности P. infestans к фунгицидам: на листовых дисках; на отделенных листьях; на молодых растениях; на клубневых дисках.

Последний метод, разработанный для оценки резистентности популяций фитофторы к ридомилу, трудно воспроизводится из-за частого бактериального загрязнения клубневых дисков.

При отсутствии у исследователей растений картофеля стабильные результаты дает метод ломтиков. Суть его заключается в том, что свеженарезанные ломтики толщиной 0,5 см из здоровых клубней восприимчивого сорта картофеля выдерживают в суспензии ридомила (100 мкг д.в./мл) в течение 20-30 мин. Затем в боковые надрезы на ломтиках (по 3-6 ломтиков на изолят) помещают препаровальной иглой кусочек спорулирующего мицелия, развившегося на ломтиках или питательных средах при выделении гриба из пораженных тканей. За контроль принимают необработанные ридомилом ломтики здоровых клубней, инокулированные испытуемым изолятом. Зараженные ломтики инкубируют во влажной камере в поддонах или кюветах при 15-18 °С в течение 4-7 суток. Развитие спорулирующего мицелия на поверхности обработанных ридомилом ломтиков указывает на присутствие резистентного изолята. Чувствительные изоляты развивают спороношение только на поверхности необработанных (контрольных) ломтиков. При использовании предлагаемого метода клубневых ломтиков для оценки резистентности изолятов P. infestans посторонние микроорганизмы не оказывают существенного влияния на результаты опытов по той причине, что закладка инокулюма в боковые надрезы на ломтиках клубней позволяет избавляться от сопутствующей микрофлоры.

Кроме того, при 15-18 °С преимущество в росте, получает возбудитель фитофтороза.

Однако наиболее прост и менее трудоемок метод листовых дисков, который применяется для оценки резистентности фитофторы к системным фунгицидам (ФАО, 1982). Ниже приводится описание модифицированного метода листовых дисков. Для приготовления маточного "раствора" (суспензии) фунгицидов используют препаративные формы (ридомил, 25 % с.п., сандофан, 25 % с.п. или диметоморф, 50 % с.п.), увеличивая расчетные навески препаратов на определенный объем воды в 4 или 2 раза, соответственно, по сравнению с чистыми действующими веществами. Кроме рекомендованных концентраций фунгицидов (0; 0,01; 0,1; 1,0; 10,0 и 100,0 мкг д.в./мл), применяют и более высокие (500 или 1000 мкг д.в./мл), особенно для ридомила. Диски диаметром 15 мм вырезают пробойником из листьев любого восприимчивого сорта картофеля (Лорх, Белорусский ранний, Адретта и др.), выращенного в теплицах или камерах искусственного климата. На один изолят используют по 5 дисков, помещенных нижней стороной вверх в чашку Петри с 10-15 мл суспензии фунгицида каждой концентрации (на каждую концентрацию фунгицида берут по две чашки Петри с дисками).

Для заражения листовых дисков используют разные методы. Если при выделении гриба из ботвы или клубней на поверхности ломтика развивается "чистый" спорулирующий мицелий (без сопутствующей микрофлоры), то его используют для инокуляции листовых дисков. Перед инокуляцией в центр каждого диска пипеткой-дозатором наносят по капле дистиллированной воды (10 мкл). Затем в каждую каплю помещают по кусочку мицелия (на кончике препаровальной иглы). Если изолят выделен в чистую культуру на питательные среды, то для инокуляции готовят конидиальную суспензию, смывая конидии с питательной среды дистиллированной водой. Концентрацию суспензии доводят до 25000 конидий/мл. Приготовленную суспензию помещают в холодильник при 4-5 °С для стимуляции выхода зооспор и затем по капле (10 мкл) наносят в центр дисков.

Оценку чувствительности (резистентности) природных популяций проводят также без выделения патогена на ломтики картофеля или в чистую культуру. Для этого отобранные в поле образцы пораженной ботвы с инфекционными пятнами 1-2-дневного возраста (загнивание растительной ткани отсутствует) помещают на сутки во влажные камеры при 15-20 °С для стимуляции конидиального спороношення. Затем конидии с интенсивно спорулирующих пятен смывают дистиллированной водой и после выхода зооспор полученные суспензии (концентрация 25000 конидий/мл) пипеткой-дозатором наносят на листовые диски. Однако следует учитывать, что оценка резистентности полевых популяций возбудителя фитофтороза в большей степени качественная, чем количественная. Поскольку одно инфекционное пятно может продуцировать чувствительные и резистентные конидии в разном соотношении, то в этом случае оценивают резистентность смешанного инокулюма. Известно, что содержание в смешанной популяции даже 10 % резистентных конидий дает на листовых дисках реакцию резистентности к ридомилу, при наличии 1 % таких конидий эта реакция наблюдается не всегда.

Чашки с листовыми дисками инкубируют при 15-18 °С с 12-16-часовым световым днем в течение 6-9 суток. Учет развития болезни на листовых дисках проводят по 6-балльной шкале: 0 – нет видимых симптомов; 1 – некрозы, 2, 3, 4 и 5 – соответственно, 5, 5-20, 20-50 и более 50 % площади диска занято спорулирующим поражением.

Для дифференциации полевых изолятов по чувствительности к ридомилу можно использовать не все рекомендованные концентрации фунгицида, а только следующие; 0 (контроль), 1 мкг д.в./мл (концентрация, близкая к минимальной ингибирующей дозе), 100 мкг д.в./мл. Отсутствие спороношения на листовых дисках при концентрации 1 мкг д.в./мл дает основание считать изолят чувствительным к ридомилу (баллы 0, 1), а развитие спороношения на дисках при концентрации ридомила 100 мкг д.в./мл указывает, что изолят резистентный (баллы 2-5). При наличии спороношения на дисках при концентрации 1 мкг д.в./мл изолят можно отнести к промежуточному типу.

Для определения среднесмертельной концентрации (СК50, концентрация фунгицида, подавляющая развитие болезни на 50 %) и уровня (фактора) резистентности используют всю серию концентраций фунгицида. В каждый опыт включают заведомо чувствительный изолят или имеют данные по СК50 для чувствительных изолятов. СК50 определяют графически на миллиметровой бумаге. На оси абсцисс откладывают концентрации фунгицида, на оси ординат – процент дисков со спороношением гриба или степень споруляции на листовых дисках при каждой концентрации фунгицида, выраженную в процентах к контролю (нулевая концентрация). По опытным данным на графике строят кривые для каждого изолята. Из точки на кривой, расположенной напротив отметки 50 % на оси ординат, опускают перпендикуляр на ось абсцисс. Полученное значение соответствует значению СК50 для данного фунгицида и данного изолята гриба. Уровень резистентности рассчитывают делением значения СК50 резистентного изолята на значение СК50 чувствительного изолята.

Добавить комментарий

Вы можете оставить свой комментарий авторизовавшись при помощи любой из представленный социальных сетей:

       


Защитный код
Обновить

Поделиться!

Понравилась статья? Расскажите о ней знакомым или оставьте комментарий!

Написать в Facebook Поделиться ВКонтакте В Google Buzz Записать себе в LiveJournal Показать В Моем Мире В дневник на LI.RU Поделиться ссылкой в Моем Круге

Авторизация